[发明专利]家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1及其重组表达载体和应用

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及家蚕PABP结合蛋白互作因子基因BmPaip1，还涉及含有该基因的重组表达载体和该基因的应用。

背景技术

随着21世纪生物工程以及基因工程的迅速发展，人们对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然来源的蛋白质提取已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，并利用菌株、细胞和昆虫等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物（昆虫）之一。绢丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的唯一器官，为整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的绢丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白（fibroin）和覆被在其外层的丝胶蛋白（sericin）构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75%，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H链、fib-L链和P25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25%，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1）、丝胶2(Sericin2）和丝胶3(Sericin3）三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。

2000年，田村等人利用piggyBac转座子介导显微注射家蚕早期胚胎获得了稳定遗传的转基因蚕；2003年，夏庆友等人完成了家蚕基因组计划，家蚕丝腺中涉及丝蛋白合成的重要编码基因如丝素重链(FibH chain)基因、丝素轻链(FibL chain)基因、丝胶1(Sericin1)基因、丝胶2(Sericin2)基因、丝胶3(Sericin3)基因以及P25基因等的启动子调控元件被鉴定和克隆，这些基础研究结果使得利用转基因技术，在家蚕特异组织如丝腺中大规模生产重组外源蛋白成为可能。近年来，国内外利用piggyBac转座子介导的转基因技术以及家蚕组织特异启动子元件在丝腺中尝试表达了多个外源蛋白，包括：在后部丝腺表达了丝素重链融合的EGFP(Zhao et al. 2010)、猫干扰素（Kurihara et al. 2007)、蜘蛛丝牵引蛋白（Zhu et al. 2010)、人Ⅲ型胶原蛋白的部分肽段(Tomita et al. 2003)、增强型红色荧光蛋白(Tomita et al. 2003)，丝素轻链融合的羟基脯氨酸胶原部分肽段(Adachi et al. 2006)、成纤维细胞生长因子(Hino et al. 2006)、增强型绿色荧光蛋白(Shimizu et al. 2007)、部分胶原蛋白肽段（Yanagisawa et al. 2007)，以及P25融合的红色荧光蛋白(Royer et al. 2005)等；在中部丝腺表达了人血清白蛋白（Ogawa et al. 2007)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita et al. (2007)、鼠单克隆抗体(Iizuka et al. 2009)、人胶原蛋白α链基因(Adachi et al. 2010)以及可溶性GM-Csf受体α(Urano et al. 2010)等。但总体上，上述研究成果的产业化推进颇为困难，主要原因在于：在丝素中生产的外源蛋白虽具有较高的含量，但重组蛋白极难纯化且易破坏其生物活性；在丝胶中生产的外源蛋白虽较容易纯化，但利用现有丝胶表达系统获得的重组蛋白含量极低而难以实现规模化生产。因此，针对外源蛋白表达合成的各个关键环节，改造并建立新的高效、稳定的表达系统，并通过转基因技术实现外源蛋白的高效生产，是解决上述瓶颈的根本出路。也是今后家蚕生物反应器开发的核心所在。