[发明专利]一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法

权利要求书

1.一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法，其特征在于：利用组织培养诱导葡萄品种雷司令花药获得的愈伤组织，经继代培养筛选获得胚性愈伤组织，以所获得胚性愈伤组织作为受体，通过根癌农杆菌介导的方法，利用选择培养基筛选获得抗性愈伤组织，再生葡萄植株，经分子检测及体式荧光显微镜观察，获得转基因葡萄苗。

2.根据权利要求1所述的一种快速建立葡萄遗传转化再生体系的方法，其特征在于，所述方法按照以下步骤进行：

(1)根癌农杆菌活化：含有绿色荧光蛋白基因gfp的根癌农杆菌菌株在LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行PCR验证，阳性表达的菌斑加入到抗性诱导培养基中，28℃，250rpm培养至OD₆₀₀＝1.0，将菌液5000rpm离心10分钟，弃上清，加入液体共培养培养基重悬，用作农杆菌悬浮侵染液，所述抗性诱导培养基配方为：5g L^-1牛肉浸膏、1g L^-1酵母膏、5g L^-1蛋白胨、5g L^-1蔗糖、4g L^-1MgSO₄·7H₂O、100μmolL^-1乙酰丁香酮、50mg L^-1卡那霉素、50mg L^-1利福平，调节pH为5.2，所述液体共培养培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、50mg L^-1水解酪蛋白、10g L^-1椰乳、5％蔗糖、100μmol L^-1乙酰丁香酮、1mg L^-1奈氧乙酸、90gL^-1甘露糖醇，pH为5.2；

(2)取继代培养后20天、生长状态良好的葡萄胚性愈伤组织，放入制备好的农杆菌悬浮侵染液，侵染20分钟，过程中间每隔5分钟摇动培养皿一次，然后倒出菌液，用灭过菌的吸水纸吸干愈伤组织表面菌液，转入固体共培养基中，28℃黑暗条件下倒置培养。三天后使用液体继代培养基清洗，所述固体共培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、50mg L^-1水解酪蛋白、10g L^-1椰乳、5％蔗糖、100μmol L^-1乙酰丁香酮、1mg L^-1NOA和0.28％脱乙酰吉兰糖胶；所述液体继代培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、50mg L^-1水解酪蛋白、10g L^-1椰乳、5％蔗糖、100μmol L^-1乙酰丁香酮、1mg L^-1NOA、1g L^-1头孢霉素和100mg L^-1二硫苏糖醇；

(3)抗性愈伤组织的筛选：清洗后的胚性愈伤组织转移到选择培养基上，每10天继代培养一次。所述选择培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、150mg L^-1肌醇、1.0mg L^-1P-CPA，0.20mg L^-1TDZ，0.5mg L^-1NOA，0.01mg L^-1GA₃、50mg L^-1水解酪蛋白、2.0mg L^-1甘氨酸、10g L^-1椰乳、200mg L^-1头孢霉素、50mg L^-1卡那霉素、5％蔗糖和0.28％脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2；

(4)阳性表达愈伤组织的鉴定：挑去选择培养基上继代培养3-4次仍然存活的愈伤组织于倒置激光扫描共聚焦显微镜下观察；同时提取RNA，反转录为cDNA进行PCR初步验证；

(5)植株再生：将阳性表达的愈伤组织转入分化培养基继续培养，再生成苗后转入生根培养基中，所述分化培养基配方为MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.5mg L^-1盐酸硫胺素、0.2mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mgL^-1烟酸、150mgL^-1肌醇、1.0mgL^-1P-CPA，0.20mgL^-1TDZ，0.5mgL^-1NOA，0.01mgL^-1GA₃、5mgL^-1的天冬氨酸、2.0mg L^-1甘氨酸、10g L^-1椰乳、5％蔗糖和0.28％脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2；所述生根培养基成分为1/2MS大量元素、MS微量元素、MS铁盐、0.1mg L^-1盐酸硫胺素、0.8mg L^-1盐酸吡哆醇、0.5mg L^-1烟酸、100mg L^-1肌醇、0.5mg L^-1α-萘乙酸钠、0.5mg L^-1NOA、50mg L^-1水解酪蛋白、2.0mg L^-1甘氨酸、3％葡萄糖和0.28％脱乙酰吉兰糖胶，pH6.2；

(6)转基因苗的鉴定及转基因植株的获得：提取转基因苗的RNA，反转录为cDNA，进行PCR验证；将PCR验证得到的阳性表达葡萄苗放置立体荧光显微镜下观察。