[发明专利]利用45Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法

权利要求书

1.一种利用⁴⁵Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，其特征在于主要包括以下步骤：

（1）油菜栽培：将普通油菜和转基因TR1油菜种植在含有MS培养基的营养土中，于光照15-17小时/天，温度23-25℃条件下培养45-55天，生长至真叶7-10片，分别取两种油菜叶片提取原生质；

（2）原生质体提取：将上述培养的两种油菜叶片切成0.4-0.6mm丝状分别置于酶解液中，在24-26℃酶解8-10h，酶解后的细胞悬浮液经100-120目尼龙网过滤，所得滤液经离心分离除去上清液，所得沉淀加入WI原生质体养护液，经离心洗涤得到原生质体；

（3）原生质体活性鉴定：将步骤（2）提取到的两种油菜的原生质体用荧光素酶FAD染色观察，选取镜检细胞存活率＞90%的原生质体进行吸收钙离子实验；

（4）原生质体培养：将步骤（3）镜检符合要求的两种油菜的原生质体分别置于含⁴⁵Ca示踪剂的WI原生质体养护液中培养11~13h；

（5）原生质体钙离子吸收量测定：将经步骤（4）培养得到的原生质体用浓度90~110mmol/L的EDTA洗涤液洗涤除去原生质体表面的钙，取0.1mL原生质体悬液经消解测量⁴⁵Ca的计数，取0.1mL原生质体悬液用于原生质体数目计数，将剩下的原生质体悬液离心分离，取0.1mL上清液用于上清液计数，通过下式分别计算两种油菜的原生质体吸收钙离子量q以鉴别两种油菜原生质体吸收钙的差异：

q=(T-H)S×k]]>

其中：T为0.1mL原生质体吸收的钙离子实际计数，单位cpm，H为0.1mL上清液计数，单位cpm，S为0.1mL原生质体细胞数目，单位个，K为钙离子实际量与液闪计数比例系数，单位mol/cpm。

2.根据权利要求1所述的利用⁴⁵Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，其特征在于，所述营养土中蛭石的重量含量为25~35%。

3.根据权利要求2所述的利用⁴⁵Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，其特征在于，所述含有MS培养基的营养土为用MS培养基溶液拌湿的营养土。

4.根据权利要求1所述的利用⁴⁵Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，其特征在于，0.1mL原生质体悬液消解测量⁴⁵Ca的计数，是在样品中加入0.1mL浓度14-15mol/L硝酸，在70~80℃下消解1~3h，消解后将其全部转移到10mL液闪液中测量计数。

5.根据权利要求4所述的利用⁴⁵Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，其特征在于，原生质体悬液消解测量⁴⁵Ca的计数，原生质体悬液的原生质体数目的计数和上清液的计数均用液闪计数器测量计数。

6.根据权利要求1所述的利用⁴⁵Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，其特征在于，切成0.4-0.6mm丝的油菜叶片置于酶解液中酶解于黑暗振荡条件下进行。

7.根据权利要求1至6之一所述的利用⁴⁵Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，其特征在于，所述原生质体用荧光素酶FAD染色观察，是通过将原生质体悬液加入到FDA染色溶液，混匀染色1-2分钟后，取混合液加载在玻片上加盖片置于显微镜下，用蓝色光照射观察，若细胞出现绿色荧光则表示有活性，否则无活性。

8.根据权利要求7所述的利用⁴⁵Ca鉴别转基因油菜和普通油菜原生质体吸收钙差异的方法，其特征在于，FDA染色溶液的制取，是先将FDA溶于丙酮中，之后再将溶有FDA的丙酮混合液加入到甘露醇中制取。