[发明专利]一种基于γ-Fe2O3纳米材料免疫磁分离食源性致病菌快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种致病菌的快速检测方，尤其涉及一种基于γ-Fe₂O₃的免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法。

背景技术

基本原理：单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。其主要的原理步骤：1. 利用γ晶型的Fe₂O₃磁珠，包被一层高分子化合物，经过修饰后后采用适当的偶联剂将待检目标菌的单克隆抗体偶联在磁珠表面，形成特异性免疫磁珠，并封闭多余活性位点。2. 将另一部分目标菌的特异性单克隆抗体采用一定的方法固定在固相载体表面，并将多余活性位点封闭。3. 将制备的特异性免疫磁珠用于抓取富集目标菌，通过外加磁场将磁珠分离出来，此时，结合了目标菌的磁珠和没有结合目标菌的磁珠还是混在一起。4. 将上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相载体表面，则抓取了目标菌的磁珠将与固相载体表面单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗可以将未发生结合的磁珠洗脱，如不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉。5. 再采用洗脱剂将固相载体上结合的特异性纳米免疫磁珠洗下来，用外加磁场将这部分磁珠分离，清洗掉离子、溶剂。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目标菌的磁珠。6.加入硝酸和硫酸进行硝化反应，这部分磁珠如果存在，则Fe₂O₃转化为三价铁离子和二价铁离子。所有食品标准中致病菌都是不得检出的。通过检测是否存在铁离子就可以检测出样本中是否存在目标菌。通过加标，在一定范围内可以定量检测目标菌。该方法中γ-Fe₂O₃磁珠既是分离富集的手段，同时也是定量检测的载体，起了一个信号放大的作用。该方法的主要优点就是快速、灵敏度相对较高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间。因此，用该方法可做大规模待检样本的阳性筛选，检出的阳性样还需用微生物培养进行确证。目前，国内外还没有文献报道这种方法，但是采用免疫磁珠进行致病菌的富集、目标物的富集等的报道还是很多的，但没有采用检验铁离子的方法做进一步的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于γ-Fe₂O₃纳米材料免疫磁分离的食源性致病菌快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价，该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。

一种基于γ-Fe₂O₃的纳米免疫磁分离快速检测出食品中的有害致病菌的方法，通过分离捕获的免疫磁珠，使其转化为铁离子，提出铁离子与目标菌的相关性指标，通过检测铁离子来间接定量目标菌。不同的致病菌检出下限不同。

该方法依赖于建立的可用于食品样品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分离。采用偶联了特异性单克隆抗体的免疫磁珠，可以将样品中的特异性致病菌进行富集；通过设计双抗夹心分离捕获到目标菌的磁珠，再将磁珠硝化反应转化为三价铁离子和二价铁离子。采用邻二氮菲吸光光度法、硫氰酸钾比色法等可以检测出铁离子的量，从而可以算出磁珠的量，通过加标定量磁珠而在一定程度间接定量出目标菌的量。通过定量分析捕获目标菌的磁珠含量，从而可以间接定量出食品样品中的有害致病菌含量。检测出的致病菌含量与磁珠含量线性相关，拟合度较好。最终以免疫磁珠与致病菌间的对应关系为纽带，确定食品样本中的致病菌菌落数。

本发明是这样实现的，步骤如下：

1）检测目标菌的特异性免疫磁珠的制备；

2）将目标菌特异性单克隆抗体固定在固相载体表面；

3）免疫磁珠富集目标菌株，并分离：将第1步制得的免疫磁珠加入待检样品，充分混合震荡，抓取目标菌后通过施加外加磁场，则磁珠就汇集到磁场一边，吸走上清液则可以分离出磁珠，若待检样本中有目标菌，则被磁珠所富集，加少量无菌的去离子水则形成目标菌的磁珠悬浊液；

4）将富集的磁珠悬浊液加到第２步制作的固定了单克隆抗体的固相载体上，若存在目标菌则形成双抗夹心；用无菌的去离子水清洗，则没有抓取到目标菌的磁珠就被洗掉，若不存在目标菌，则所有磁珠都被洗掉；