[发明专利]基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂盒及其测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂及其测定方法，属于医疗检测领域。

背景技术

作为自身免疫病的重要血清标志物，人体自身抗体的快速检测对于自身免疫性疾病的诊断、预后和转归判断及理解疾病的病理过程有重要的应用价值和理论意义。本发明适用于体外定性检测人血清中可提取性核抗原(ENA)自身抗体，包括抗Sm(史密斯抗体)、抗U₁RNP(U1小分子细胞核核糖蛋白抗体)、抗SSA(干燥综合征抗原A抗体)、抗SSB(干燥综合征抗原B抗体)、抗rRNP(核糖体P蛋白抗体)、抗Scl-70(DNA拓扑异构酶1抗体)、抗Jo-1(组氨酰-tRNA合成酶抗体)。

目前，市面上的自身抗体检测膜条产品只有一条包被抗人IgG抗体的质控线，这种方法只能判断检测时是否添加了检测样本，而不能判别检测过程中加入的AP酶活性是否有效。

临床上常用的自身抗体检测方法主要有：免疫双扩散法、间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、免疫印迹法等。其中免疫双扩散法是经典的实验方法，其特异性高，价格低廉，但操作费时，且肉眼观察沉淀环，结果灵敏度低。对实验操作人员经验和操作水平要求高，结果一致性较差。间接免疫荧光法是检测自身抗体的常用技术，其特异性判断需经过ELISA、免疫印迹等技术的二级确认，同样对实验操作人员经验和操作水平要求高，且结果一致性差。酶联免疫吸附法具有较高的成熟度，灵敏度高、特异性较好，操作方法简便快速、无放射性污染且检测结果排除了人为的主观判断，然而，该方法一次实验仅能检测单一指标，通量低，成本较高，应用推广难度大。免疫印迹法是在凝胶电泳和固相免疫检测技术基础上发展起来的一种免疫生化检测技术，具备SDS-PAGE的高分辨率和固相免疫测定的高特异性和高敏感性的特点，但目前市面上基于该方法的自身抗体检测膜条产品只有一条包被抗人IgG抗体的质控线，不能判别检测过程中加入的AP酶活性是否有效。

发明内容

为了克服上述方法检测自身免疫性疾病过程存在的不足，节省时间、人力和资金，本发明提供了一种定位准确、价格低廉，多种蛋白联合检测的免疫印迹法自身抗体检测试剂。

本发明目的在于提供一种基于免疫印迹法的自身抗体检测试剂，能同时检测包括抗Sm、抗U₁RNP、抗SSA、抗SSB、抗rRNP、抗Scl-70、抗Jo-1等7种抗体，并且该检测试剂经过喷印包被设置了两条质控线，分别包被有人IgG蛋白和抗人IgG抗体，用于指示检测过程是否正常进行和酶免试剂是否有效，为进一步的明确判断提供有价值的参考依据。

本发明的主要技术方案是：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法，将ENA按照分子量大小依次分开，通过转印技术转移至硝酸纤维素膜上，对该硝酸纤维素膜条进行喷印包被设置两条质控线，然后将含有质控线和ENA抗原的硝酸纤维素膜放入反应槽中，与待测血清进行反应，如待测样本中含有自身抗体，则膜条上原本按照分子量依次分开的各种ENA相关抗原，将会与待测血清中含有的抗体发生特异性结合，再加入酶标试剂和显色剂，进行显色反应，将显色区带与标准对照区带对比即可判断待测样本中所含有的ENA抗体类别；其抗体的有无和抗体种类和数量，对诊断和鉴别风湿病等自身抗体疾病具有重要的临床意义。同时，本发明涉及的硝酸纤维素膜上喷印有人IgG的质控线1，用于检测加入酶结合物中酶的活性是否失效，无论ENA抗体阴性或阳性血清，只要试剂有效，在膜条的质控线区域，均能显示出棕色区带；阳性血清在ENA抗原转印区还能显示对应阳性区带。质控线2包被有抗人IgG抗体，用于初步定性指示样本液体中所含IgG抗体量的程度。若试剂失效(主要指酶标抗体、显色液1、显色液2)，则膜条质控线区域不会有任何区带。本发明不但可以判断待测样本中含有何种ENA抗体，还可以断定检测结果是血清ENA抗体阴性还是试剂失效，有效解决了用户在遇到不显色的膜条时，难以断定是血清ENA抗体阴性还是试剂失效的问题，同时可初步知识样本液体中所含IgG抗体量。

经喷印机喷印包被，在固相膜上附着两条质控线。

所述质控线1包被有人IgG蛋白。

所述质控线2包被抗人IgG抗体。

所述质控线1用于检测加入的抗体中所标酶的活性是否失效，如酶的活性失效，则此条带不显色。

所述质控线2的抗人IgG抗体质控线显色颜色的深浅用于初步定性指示样本液体中所含IgG抗体的情况。

同时，本发明还提供了上述试剂的测定方法，包括以下步骤：