[发明专利]一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白及其制备方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种原核生物来源的D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

D-氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase: Oxidoreductase, DAAO, EC 1.4.3.3) 是一种以黄素腺嘌呤(Flavin adenine dinucletide, FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类，可氧化D-氨基酸的氨基生成相应的酮酸和氨。反应如下所示：

RCHNH₂COOH  +  E-FAD  →  RC=NHCOOH  +  E-FADH₂

E-FADH₂  +  O₂  →   E-FAD  +  H₂O₂

RC=NHCOOH  +  H₂O  →  RCOCOOH  +  NH₃ 

D-氨基酸氧化酶对催化反应底物有高度的立体异构选择性和广谱性，可被广泛用于D-氨基酸的定性定量分析、生物传感器、L-氨基酸和α-酮酸的生产。20世纪90年代，DAAO在生物技术酶催化方面得以应用，主要用于两步酶法转化头孢菌素C (Cephalosporin C, CPC)生产7-氨基头孢烷酸（7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA）。DAAO广泛存在于自然界中，在许多真核生物体中都发现存在DAAO，包括酵母、真菌、昆虫、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类。继猪肾D-氨基酸氧化酶（pig kidney D-amino acid oxidase , pkDAAO）第一个被提取并获得的纯化的黄素蛋白之后，1987年，科学家从纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)中纯化获得了D-氨基酸氧化酶(RgDAAO)，这也是首次从微生物中纯化得到黄素蛋白。目前已有猪肾pKDAAO、纤细红酵母RgDAAO和人源hDAAO等蛋白晶体结构得到解析。

有关原核生物DAAO的研究报道还很少，仅Birgit Geueke等人2006年首次也是唯一的一次报道了关于原核生物原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protophormiae, DSM 15035) 中apdaao基因的克隆和表达，酶蛋白ApDAAO具有较为广泛的底物特异性，其最适反应底物为D-甲硫氨酸，此外对D-赖氨酸、D-精氨酸、D-苯丙氨酸等具有一定活性。有关D-氨基酸氧化酶的商品还很少，目前仅有来自猪肾的D-氨基酸氧化酶pKDAAO得到了很好地开发和应用，然而由于该产品价格昂贵导致成本上升。因此，开发新型的、成本低廉的D-氨基酸氧化酶迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶活力提高的原核生物来源的D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白。

本发明的目的还在于提供一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白的制备方法。

本发明的目的是这样实现的。本发明提供的一种D-氨基酸氧化酶的突变体酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其中：

（1）SEQ ID No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第115位的谷氨酸（E）突变为丙氨酸（A）；

（2）SEQ ID No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第119位的天门冬酰胺（N）突变为天门冬氨酸（D）；

（3）SEQ ID No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第286位的苏氨酸（T）突变为丙氨酸（A）。

本发明还提供编码上述突变体酶蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供含有上述基因的载体及宿主细胞。

本发明还提供含有上述基因的工程菌。

本发明还提供上述突变体酶蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据NCBI数据库中公开的来自原玻璃蝇节杆菌（DSM20168）的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列，在与同源蛋白序列比对的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物对；

所述的115位突变引物为：

115位anti-sense：5′-CCTCCCGGGCGGATCTGC-3′；

115位sense：    5′-GGCAGATCCGCCCGGGAG-3′；

119位突变引物为：