[发明专利]一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗体的检测试纸卡

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗体的检测试纸卡。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患全身传染病，在世界各地都广泛流行，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病，是国际贸易检验中必检的一种传染病。布鲁氏菌为革兰氏阴性短小杆菌，初次分离时多呈球状，球杆状和卵圆形，布鲁氏菌可感染包括人类在内的多种家畜和野生动物，主要通过消化道、皮肤黏膜、呼吸道等途径侵入机体，感染后引起相似的临床症状，如长期发热、流产与不育、虚弱、关节痛及肝脾肿大等。牛布鲁氏菌病为布鲁氏菌病中较为严重的一种。

为防控该病，各国学者建立了多种布鲁氏菌病诊断和检测技术，主要有：(1)血象诊断：白细胞半数正常或轻度减少，淋巴细胞相对或绝对增多，分类可达60％以上，血沉在各期均增速，久病者有轻或中度贫血。(2)细菌学检查：患者血液、骨髓、乳汁、子宫分泌物做细菌培养。(3)免疫学检测：包括血清凝集、补体结合、抗人球蛋白检测、ELISA等。(4)PCR。

血象诊断只能作为初步的诊断方法，不能作为确诊病症的方法；细菌学检查方法耗时长，假阳性和假阴性的概率高，实验条件也不易控制；免疫学检测是一种快速检测的方法，但目前的检测方法都存在灵敏度低，有交叉反应的情况；PCR为目前较常用的该疫病的诊断方法，但均存在样品前处理复杂、仪器设备昂贵、分析费时、要求熟练的专业技术人员才能完成等问题。这些方法均不适用于设备简单、技术人员缺少的基层单位对该病开展广泛检测。

免疫胶体金技术自问世以来，得到了迅速发展。广泛应用于化学检测和免疫学检测领域，尤其是胶体金免疫层析技术具有操作简单、快速灵敏、结果清楚、易于判断和保存，且无需任何仪器设备等优点。更适合于临床快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敏感度高、特异性好、操作简单、低成本的利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗体现场快速检测试纸卡及其检测方法。

一种利用夹心法检测牛布鲁氏菌抗体的检测试纸卡，所述检测试纸卡由外壳1和其内部的试纸条2构成，外壳1由上板3和下板4构成，上板3有检测窗5和加样孔6，试纸条2由底板7和在底板7上依次粘贴的样品吸收垫8、胶体金标记垫9、检测反应区10构成，样品吸收垫8正对加样孔6，检测反应区10正对检测窗5。

所述胶体金标记垫9包被有牛布鲁氏菌抗原-胶体金标记物。

所述牛布鲁氏菌抗原-胶体金标记物的制备方法为：

(1)将牛布鲁氏菌抗原在0.005M/L pH7.0的NaCl溶液中4℃透析过夜，4℃，10000-12000rpm条件下离心1h；

(2)将OD526的胶体金溶液的pH调节至4.0-9.0；

(3)将步骤(1)离心得到的牛布鲁氏菌抗原用0.005M/L pH9.0的硼酸盐缓冲溶液稀释至5μg/ml～50μg/ml，取1ml稀释后的牛布鲁氏菌抗原加入到1ml胶体金溶液中，振荡混匀，静置5min，加入0.1ml10％的NaCl溶液，混匀后静置2h，离心纯化制得胶体金标记的牛布鲁氏菌抗原。

所述检测反应区10由包被牛布鲁氏菌抗原-载体蛋白偶联物的测试区11和包被牛布鲁氏菌抗体的质控区12组成。

所述牛布鲁氏菌抗原-载体蛋白偶联物的制备方法为：

(1)取5mg牛布鲁氏菌抗原和2.5mg载体蛋白溶解在250μl TE buffer中，充分震荡使其溶解，再取EDC·HCl79mg充分溶解于250μl TE buffer中；

(2)将牛布鲁氏菌抗原和载体蛋白的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC·HCl溶液，在37℃摇床中反应2h以上；

(3)先用Sephadex柱分离步骤(2)反应后的偶联产物和未结合的牛布鲁氏菌抗原，再透析纯化，将0.5ml溶液在PBS中透析3d，每天换液两次，每次换液200ml，透析产物分装成20份，于-20℃保存，得到牛布鲁氏菌抗原-载体蛋白偶联物。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白或鸡卵白蛋白。

所述样品吸收垫含有植物凝集素或抗红细胞抗体。

所述抗红细胞抗体为使用人红细胞免疫小鼠、羊或兔，常规制备的抗红细胞单克隆抗体。

所述检测牛布鲁氏菌抗体的检测试纸卡的检测方法，其特征在于，按照如下步骤进行：