[发明专利]一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒，包括超纯水、X溶液、10×PCR缓冲液，PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于所述的PCR引物包括以下CYP2C19基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如下表所示：

其中，2*G/2*A表示该2号SNP位点有两种可能基因型G或A，两条反向引物分别指检测该SNP位点相应基因型G或基因型A的引物，在检测该SNP位点时两条引物要同时加到反应液中，3*G/3*A表示该3号SNP位点有两种可能基因型G或A；17*C/17*T表示该17号SNP位点有两种可能基因型C或T。

2.根据权利要求1所述的一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于：包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。

3.根据权利要求1所述的一种CYP2C19基因多态性检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照品为克隆到载体pMD18-T上的7个DNA片段和1个质粒pcDNA3.1(+)，所述的7个DNA片段分别为包含有SNP位点上rs4244285的G型基因和A型基因、rs4986893的G型基因和A型基因、rs12248560的C型基因和T型基因及人类基因beta-globin的片段。

4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的CYP2C19基因多态性检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）DNA样品的收集和提取

将刮取到口腔上皮细胞的口腔拭子放入300μL DNA裂解缓冲液中，在恒温混匀仪中于95°C，1000rpm的条件下，处理5分钟后取出，室温放置至冷却，然后在样品中加入30μL提取缓冲液，混匀，12000g离心5分钟，得到的上清液即为PCR的DNA样品模板；

（2）以提取的核酸为模板进行PCR反应

取DNA样品9.3μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶0.7μL，X溶液2μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：94°C1分钟；94°C30秒钟，60°C30秒钟，70°C1分钟，循环35次；70°C1分钟；4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记，PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM；所述的PCR引物包括以下CYP2C19基因上的3个SNP位点上的不同基因型的正反向扩增引物、DNA内参的正反向扩增引物及反应内参的正反向扩增引物，其基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.13所示；

（4）GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

取PCR产物0.1-1μL，，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液30μL，DNA标准品0.2μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，获得CYP2C19基因的SNP位点的等位基因型。