[发明专利]一种同步检测二十二种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种同步检测二十二种呼吸道病原体的试剂盒，包括DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液，10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，其特征在于：所述的反转录引物包括以下表中九种呼吸道病原体的RT扩增引物及人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括以下表中余下十三种呼吸道病原体的正反向PCR扩增引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述九种呼吸道病原体的PCR扩增引物及人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表所示：

2.根据权利要求1所述的一种同步检测二十二种呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于：所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。

3.根据权利要求1所述的一种同步检测二十二种呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照品连接有设计上述二十二种呼吸道病原体、RNA内参、DNA内参和反应内参的引物的基因保守序列的pMD18-T的克隆载体。

4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的同步检测二十二种呼吸道病原体的试剂盒的检测呼吸道病原体的方法，其特征在于具体包括以下步骤：

（1）采集样本并提取核酸

采集呼吸道感染患者的鼻咽拭子或痰液的分离培养物，从分离培养物中提取核酸；

（2）以患者核酸为模板进行RT反应

取5-20ng/ul的核酸样品RNA5μL，DEPC水8μL，5×RT缓冲液4μL，RT引物溶液2μL，RT酶1μL混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件：48°C1分钟；42°C60分钟；95°C5分钟；4°C直至收取RT产物；其中反转录引物溶液中各RT引物浓度均为500nM，所述的RT引物包括九种呼吸道病原体的RT扩增引物及人RNA内参的RT扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1～NO.10所示；

（3）以反转录产物为模板进行PCR反应

取RT产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM的氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，X溶液2μL混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95°C10分钟；94°C30秒钟，55°C30秒钟，70°C1分钟，循环35次；70°C1分钟；4°C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA；反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记，PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，所述的PCR引物包括余下十三种呼吸道病原体的正反向PCR扩增引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述九种呼吸道病原体的PCR扩增引物及人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如序列表中SEQ ID NO.10～NO.50所示；

（4）GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品

取PCR产物1μL，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75μL，DNA标准品0.5μL，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，判断呼吸道病原体的种类。