[发明专利]一种将穿梭质粒导入黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）的转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌转化领域，具体涉及一种将质粒转化导入黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）中的方法，包括野生型和营养缺陷型。

背景技术

黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中。由于黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）的特性，一般化学法制备的感受态细胞很难将质粒导入黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）细胞，或者在基因工程菌构建中常用的转化法是电击转化比较容易将质粒导入细胞，但是电击转化黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）所用的感受态细胞制备的培养基原料较昂贵，操作相对简单，但转化效率不太高，电压（电容与电阻的设置）和时间参数是关键参数。而对于条件比较简陋的实验室来说，电转设备缺乏的情况下，用此化学方法制备感受态细胞，并将质粒转化进入细菌中，37℃恒温培养一段时间后，质粒能够在细菌中稳定遗传，是一个节省成本的好方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种比较简便的特殊培养基培养的方法制备黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）感受态细胞，并恒温培养将质粒导入其细胞能稳定遗传的简便方法。

本发明提供的制备黄色短杆菌（或谷氨酸棒杆菌）感受态细胞并转化的方法：

（1）所述感受态细胞制备步骤如下：

挑取一新鲜培养的营养缺陷型黄色短杆菌AN78单菌落接种于2.5 ml GM I 培养基中， 30℃, 130-150 rpm的条件下，振荡培养过夜；将过夜培养物按10%接种量转接到2.5ml新鲜的GM I 中，37℃ 200-230 rpm 振荡培养3.5h；再将培养物进行第二次传代，接种于5 ml GMII 培养基中，按5%接种量进行第二次传代，37℃ 200-230 rpm 振荡培养90 min，取1 ml 培养物， 5000 rpm 室温离心5 min，用1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为营养缺陷型黄色短杆菌感受态细胞。同理，将谷氨酸棒杆菌ATCC 13032制备成的感受态细胞，方法类似于上述制备营养缺陷型黄色短杆菌感受态细胞，营养缺陷型的菌株，所加的试剂是氨基酸，非营养缺陷型的菌株，将氨基酸改用无菌水代替。所述GM I 生长培养基的溶剂为水（如双蒸水），溶质及其浓度如下：15% K₂HPO₄·3H₂O，6% KH₂PO4，2% (NH₄)₂SO4，0.2% MgSO₄，1% 柠檬酸钠，将上述各成份溶于蒸馏水中，6.6×10⁴ Pa高压灭菌，室温保存；10% 酵母粉，1% 水解酪蛋白，25mM MgCl₂（MgCl₂·6H₂O，分子量为203），高压灭菌，酵母粉溶液最好现配现用，水解酪蛋白和MgCl₂溶液可室温储存；20%葡萄糖，0.25% 所需氨基酸His（组氨酸）、 Pro（脯氨酸）、Met（甲硫氨酸），0.1MCaCl₂（CaCl₂·2H₂O，分子量为147），用0.22μm 的微孔滤膜除菌，葡萄糖溶液和CaCl₂ 室温储存，氨基酸溶液-20℃保存。

（2）所述将穿梭质粒导入营养缺陷型黄色短杆菌AN78（或谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032）细胞的步骤如下：

取质粒pXMJ19、pXMJ19-argH和无菌水各10μl加至营养缺陷型黄色短杆菌AN78感受态细胞悬浮液中，至终浓度1μg/ml，质粒体积不超过感受态细胞悬液体积的1/20，混匀。37℃水浴中静置30-60 min，37℃ 200 rpm振荡培养2-4 h，涂布于含有氯霉素（30μg/ml）的LB固体培养基上，每100 μl转化体系涂1个平板，每一种黄色短杆菌的转化体系涂5个平板，37℃倒置培养过夜。计算平均转化率（转化子个数/μg DNA）。由于黄色短杆菌是营养缺陷型，在LB固体培养基中加入3%的氨基酸混合液（0.25% His，Pro，Met），营养缺陷型黄色短杆菌AN78生长良好。 同理，谷氨酸棒杆菌13032转化实验流程类似于黄色短杆菌AN78，由于谷氨酸棒杆菌13032是野生型标准菌株，在涂布转化体系的LB平板时，不加入氨基酸混合液。

LB 液体培养基（PH 7.2）的制备方法： 将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和双蒸水充分混匀并用双蒸水定容至1L。