[发明专利]一种大鳞鲃鱼肾细胞体内培养制备染色体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类染色体的制备方法。

背景技术

大鳞鲃(Barbuscapito)属鲤科(Cyprinidae)、鲃亚科(Barbinae)、鲃属(Barbodes)，原产于乌兹别克斯坦的咸海。它具有食性广、生长速度快、肉质鲜美、耐盐碱、适应性强等优良性状，其最大个体长70cm、重12kg，是当地重要的大型经济鱼类(尼科里斯基著，缪学祖，林福申，田明诚译.分门鱼类学[M].北京：高等教育出版社，1958：186-189.)。2003年黑龙江水产研究所将该鱼引入我国，旨在增加内陆盐碱水域鱼类养殖品种，以促进盐碱水域的开发和利用。

染色体是遗传物质的主要载体，染色体数与染色体核型是生物细胞遗传学研究的主要内容之一，对认识和探索生物的染色体演化过程、分类系统及进化关系具有重要意义，还可为鱼类遗传育种提供细胞遗传学依据。染色体制备是细胞遗传学研究中的一项基本的技术，快速、简便地获得形态好、分裂指数高的染色体结果是进行核型分析的前提和基础。目前，鱼类染色体制备方法主要分为直接法、体内培养法和细胞培养法三大类，虽然制备原理基本相同，但由于不同鱼类组织结构的不同及处理方法的差异，得到的细胞分裂中期相的数量和质量也不尽相同。因此，每种鱼类成熟的染色体制备条件还是需要不断摸索和反复试验才能建立。目前，涉及大鳞鲃染色体的体内培养制备方法还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种大鳞鲃鱼肾细胞体内培养制备染色体的方法。

本发明的一种大鳞鲃鱼肾细胞体内培养制备染色体的方法是按以下步骤进行的：

一、活体注射：用5～10ppm苯氧乙醇将大鳞鲃鱼麻醉后称重，第一次活体腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，剂量与大鳞鲃鱼体重的比为7～12μg∶1g，16～20h后第二次活体腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，剂量与大鳞鲃鱼体重的比为5～10μg∶1g，作用4～6h后注射质量浓度为0.1％～0.2％的秋水仙素，剂量与大鳞鲃鱼体重的比为5～10μg∶1g，反应时间为2～4h；

二、取样：将步骤一处理的大鳞鲃鱼剪鳃，水中放血10～15min，然后取出头肾于质量浓度为0.7％～0.9％的NaCl生理盐水中洗涤，用手术剪剪碎至生理盐水变浑浊为止，静置3～5min后用吸管收集上层细胞悬液于离心管中，在转速为1000～1500r/min的条件下离心5～10min，弃上清，收集细胞；

三、低渗：向步骤二收集的细胞中加入低渗液，用吸管吹打至细胞均匀分散后，室温反应40～60min；其中低渗液由质量浓度为0.1％～0.5％的KCl溶液和质量浓度为0.1％～0.5％的柠檬酸钠溶液按体积比为1∶1～2混合而成；

四、固定：将步骤三低渗的细胞在转速为1000～2000r/min的条件下离心5～10min，留0.3～0.5mL的上清液吹打成细胞悬液后，加入卡诺氏固定液固定20～30min；

五、重复步骤四的操作1～2次后，在1000～1500r/min的转速下离心5～10min，弃上清液，沉淀物用卡诺氏固定液吹打成细胞悬液后置于-18～-20℃下冷冻过夜；

六、冷滴片：把步骤五冷冻的细胞悬液离心后弃上清液，加入2～3mL的卡诺氏固定液混合均匀，取浸泡在冰水混合液中预冷的干净载玻片，分散滴上2～3滴细胞悬液，立即将载玻片在酒精灯火焰上方过3～5次，使染色体分散和展开，然后于室温下干燥；

七、染色：将步骤六干燥的染色体载玻片用体积分数为10％～15％的吉姆萨(Giemsa)染色液染色30～50min，自来水冲洗，自然干燥后完成染色体标本制备，即得到大鳞鲃鱼染色体。

本发明包括以下有益效果：

1、本发明采用两次注射植物血球凝集素(PHA)，第一次剂量与大鳞鲃鱼体重的比为7～12μg∶1g，第二次剂量与大鳞鲃鱼体重的比为5～10μg∶1g，使鱼体细胞增殖效果较好；

2、本发明的秋水仙素的注射剂量与大鳞鲃鱼体重的比为5～10μg∶1g，反应时间为2～4h，可较好的将细胞分裂停留在中期，获得形态较好、图像清晰的染色体中期分裂相；

3、本发明在处理头肾组织时采用质量浓度为0.7％的NaCl生理盐水，接近肾细胞的渗透压，避免细胞受外液渗透压影响破碎；

4、本发明的低渗液成分为质量浓度为0.2％的KCl和质量浓度为0.2％的柠檬酸钠混合溶液，KCl的优点是染色体轮廓清楚，可染色性强，柠檬酸钠的优点是具有良好的pH调节及缓冲性能，两者混合使用，在细胞低渗过程中能保持染色体周围环境的稳定，利于染色体形态保持完整；