[发明专利]一种稳定安全的枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种稳定安全的枯草芽孢杆菌制剂的制备方法包括以下步骤：

（1） 菌种活化：

本发明采用枯草芽孢杆菌作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号，GIM 1.131，将-80℃保存的枯草芽孢杆菌菌种在种子培养基（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，琼脂粉15g，加水至1升，高温高压灭菌备用）固体斜面上划线，37℃培养16个小时左右，活化；

（2）制备一级种子：

将活化的枯草芽孢杆菌，用接种环挑取一环接种于300 mL 液体种子培养基中（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，加水至1升，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，37℃，250rpm，振荡培养16~20小时后，制得一级种子液；

（3）配制固体发酵培养基：

固体干基：以豆饼粉、玉米粉和小麦粉为基础料（质量之比为3:1:1），葡萄糖5.0%，CaCO₃ 1.5%，MnSO₄·H₂O 0.04%。将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值调为6.5，搅拌均匀。将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

（4）固体发酵：

将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得二级种子。将二级种子按照10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得三级种子。可以根据具体的培养

用量，进一步将三级种子按照10%的接种量进一步扩大培养。将枯草芽孢杆菌培养物进行菌落计数，要求活菌体浓度可达1.0×10⁸ CFU/g 鲜曲以上，芽孢形成率在90%以上；

（5）稳定化处理： 

将烘干的枯草芽孢杆菌固体发酵培养物，加入质量比为0.25%的聚丙烯酸钠和5%的PEG4000（预先溶解于水），搅拌混匀，晾晒或者65℃下加温处理60min以内干燥制得成品。    

2.根据权利要求1所述的稳定安全的枯草芽孢杆菌制剂，其特征在于所述的固体干基：以豆饼粉、玉米粉和小麦粉为基础料（质量之比为3:1:1），葡萄糖5.0%，CaCO₃ 1.5%，MnSO₄·H₂O 0.04%。

3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌固体发酵，其特征在于：培养温度为温度为35~37℃，湿度为50~70%。

4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌固体发酵，其特征在于：各级种子菌接种量为10%的接种量。

5.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌固体发酵，其特征在于：所用的菌种为芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌。

6.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌固体发酵，其特征在于：作为饲料添加剂的添加量为0.5~2%。

7.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌发酵，其特征在于：作为饲料添加剂的应用领域为畜禽饲料添加剂。