[发明专利]一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及埃里希氏菌感染的分子诊断的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒。

背景技术

埃里希氏菌是生存在单核白细胞和嗜中性白细胞的胞浆内的专性细胞内寄生菌。埃里希氏菌病经蜱虫传播，在世界范围内广泛存在，引起人和多种动物(牛、狗、羊)以发热和贫血为主要特征的疫病。此病的临床诊断主要依赖于流行病学和发病症状，结合血液涂片的显微镜观察法检出埃里希氏菌。临床诊断的灵敏度较低，现有的血清学诊断方法不能区分感染后的康复者和临床感染者。

感染人畜的埃里希氏菌的重要的种包括：犬型E.canis,人型E.chafeensis和E.ewingii,牛型E.ruminatium，羊型E.ovina,鼠型E.muris。不同种的埃里希氏菌感染宿主的专一性不强，而现有的分子诊断技术仅可以检测单一种的埃里希氏菌。本发明建立了一套高灵敏度和高特异性、快速的检测埃里希氏菌的、适合临床使用的分子诊断方法。

发明内容

为了解决现有分子诊断技术只能检测单一种埃里希氏菌的不足，本发明提供一种快速、特异性强、灵敏度高、适合临床使用的定量PCR检测所有种的埃里希氏菌的引物、探针及试剂盒。

本发明的原理和核心是科学地设计扩增和检测埃里希氏菌的特异、高效的引物和探针。在保证设计的引物高效扩增埃里希氏菌、设计的探针特异检测埃里希氏菌的同时，确保此引物和探针不扩增和检测其它类似的微生物（anaplasma无形体、Bartonella巴尔通体、Rickettsia立克次氏体、Neorickettsia新立克次氏体、Coxiella考克斯氏菌、Mycoplasma支原体）。此外，本发明设计的探针和不同种的埃里希氏菌的基因序列有不同程度的差异（有1-3个碱基的差异），高分辨率熔点曲线技术会显示不同种埃里希氏菌的熔解温度的差异，这可以方便的用于基因分型。

从GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）获取如下埃里希氏菌以及相关细菌的16S rDNA的序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行对齐：无形体（基因序列号：Anaplasma equi AF172167，Anaplasma platys M82801,Anaplasma phagocytophilum AY055469,Anaplasma bovis HQ913646,Anaplasma marginale AF309866和AF414873），巴尔通体（Bartonella henselae AY513504），立克次氏体（Rickettsia rickettsia L36127），考克斯氏菌（Coxiella burnetii D89798），支原体(FR869692),新立克次氏体(Neorickettsia helminthoeca U12457,Neorickettsia rickettsia NR_029162),牛型埃里希氏菌(Ehrlichia orCowdria ruminatium U03776,U03777,CR925678,DQ647616),鼠型埃里希氏菌（Ehrlichia muris AB013008,AB196302),羊型埃里希氏菌（Ehrlichia ovina AF318946),犬型埃里希氏菌（Ehrlichia canis(GU810149),人型埃里希氏菌（Ehrlichia chafeensis AF147752,ECU60476；Ehrlichia ewingii M73227,U96436)。

引物和探针的选择基于对齐序列的保守区和变异区。附图1、2、3、和4显示设计的引物和探针：

上游引物：5’-GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3’（SEQ ID NO.1）；

下游引物：5’-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3’（SEQ ID NO.2）；

探针-1：5’-ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3’（SEQ ID NO.3）；

探针-2：5‘-LCred640 　GAAGGTCGTATCCCT CTTAACAGG-phos（磷酸）-3’（SEQ ID NO.4）

本发明还公开了埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型试剂盒，该试剂盒由下列组成：（1）5x定量PCR反应液；22μl；（2）22μl的5x的探针和引物混合液有浓度为5μM的上游引物、5μM下游引物、1μM的探针-1、1μM的探针-2。