[发明专利]一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法

权利要求书

1.一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法，包括以下步骤：

（1）设计引物：参照GenBank中H4和H9禽流感病毒的HA基因序列，设计两对引物H9-HA-F、H9-HA-R和          H4-HA-F、H4-HA-R，用于扩增HA基因片段，序列为：

H9-HA-F：5'-GCCTGCTAGATCAAGTAGAGG-3'；

H9-HA-R：5'-TGGAACCCAATGCCCTCTTC-3'；

H4-HA-F：5'-AGCAAAAGCAGGGGAAACAATGC-3'；

H4-HA-R：5'- agtagaaacaagggtgttttttctc-3';

H4扩增片段长度1738bp、H9扩增片段长度404bp;

（2）提取核酸：将已知的H4和H9毒株样品等体积进行混合，并取200ul混合液加入1.5ml无RNA酶的离心管中，再加入1ml的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟；加入0.2 ml的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后进行12000 g离心15 min，将水相转移到另一无RNA酶的离心管中，加入与水相等体积的异丙醇，室温静置10 min，12000g离心15min，除去上层清液，向沉淀中加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，12000 g离心5min，除去上层清液，超净台内风干RNA沉淀，加入10ul DEPC水充分溶解RNA，同时设H4和H9单一病毒作为对照;

（3）RT-PCR反应的反应体系：

2x Buffer                        25μl

混合酶                       10U

H4-HA-F引物(10μM)           10～20pM

H4-HA-R引物(10μM)           10～20pM

H9-HA-F引物(10μM)          10～20pM

H9-HA-R引物(10μM)          10～20pM

RNA模板                      10ul 

RNase-free ddH₂O               补至50μl；

（4）扩增条件：第一步50 min 50℃，1个循环；第二步94℃3 min，1个循环；第三步94℃1.5 min，52℃1.5 min，72℃2 min，35个循环，第四步72℃延伸7min，1个循环，4℃保存；

（5）产物鉴定：取5??L上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，以Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，以5V/cm电泳1h，凝胶成像系统观察结果。

2.根据权利要求1所述的一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法，其特征在于：上述步骤（3）中所述混合酶为反转录酶和Taq DNA混合酶。

3.根据权利要求2所述的一种H4和H9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法，其特征在于：所述反转录酶和Taq DNA各5个单位。