[发明专利]一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法。

背景技术

海胆为棘皮动物门(Echinoderma-to)海胆纲(Echinoidea)动物。海胆以其生殖腺供食，其生殖腺又称海胆卵、海胆籽、海胆黄、海胆膏，色橙黄，味鲜香，占海胆全重的8%～15%。目前世界上已发现的海胆有850余种，常见的包括光棘球海胆（也称大连紫海胆）、紫海胆以及马粪海胆。

海胆纲的一些种类自古即为滋补佳品，常用于预防和治疗一些疾病，这些功能主要是由其所含多糖、蛋白、脂肪酸、色素、微量元素等活性物质成分决定的，各成分的鉴定及功效正在被逐渐证明。另外海胆中还含有一些共附微生物，但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有被充分利用。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉、利用海胆卵制备海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的方法，克服现有技术的不足。

本发明的一种海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的制备方法，步骤如下：

a. 取健康、新鲜的海胆卵研磨后，将200 μL研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，在37℃恒温条件下培养2天；

b. 挑取单菌落反复划线培养至纯菌株；得到海胆共生多粘芽孢杆菌DNC2（Bacillus polymyxa）；该菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号: CGMCC No: 7078；

c. 将DNC2菌株在pH9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35℃条件下发酵1 天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨所占的质量百分比分别为3%和6%；

d．在4000 r/min的条件下离心去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为60%，4℃静置过夜，在10000 r/min条件下离心处理30 min，将沉淀物用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中的物质冷冻干燥，得海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白。

本发明的海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白的应用。

本发明的方法操作简单、成本低廉，从海胆共生多粘芽孢杆菌菌株DNC2的发酵液中所提取的抗肿瘤活性蛋白抗肿瘤活性强，对白血病k562细胞株、人肝癌HepG2，乳腺癌MDA-MB-231和MFC-7均有明显的抑制活性，因此可应用于抗肿瘤药品的制备，具有产业价值。

本发明中的海胆源多粘芽孢杆菌菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号: CGMCC No: 7078。

具体实施方式

本发明的实施例依次按如下步骤进行：

a. 将打捞后的新鲜海胆，在超净工作台内用无菌水清洗5遍后，取干净、新鲜的海胆卵用研磨机充分研磨成匀浆后，将200 μL研磨液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨平板培养基上，37℃恒温培养2天。

b. 挑取单个形态各异的菌落反复划线培养至出现纯菌株，用滤纸片法检测各纯菌株的抑菌活性作为初步筛选标准，结果表明DNC2菌株抑菌活性明显。

对DNC2活性菌株利用16sRNA分子鉴定确定其为芽孢杆菌属，通过耐盐性试验、对溶菌酶抗性试验、V.P实验、苯丙氨酸、丙二酸盐实验、柠檬酸盐利用、产糊精结晶、油脂水解、淀粉水解、二羟丙酮的形成、过氧化氢酶、酪氨酸水解、产硫化氢、明胶水解、对溶菌酶抗性、石蕊牛乳实验、糖发酵、硝酸盐还原、产生吲哚、动力实验、卵磷脂酶、甲基红实验、酪素水解等生理生化试验将其鉴定到种，该活性菌株为多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa），该菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号: CGMCC No: 7078；

c.以抑菌圈平均直径为标准，优化次级代谢产物产生的最佳条件，在pH 9的牛肉膏蛋白胨液体培养基中35℃发酵1 天，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基中牛肉膏和蛋白胨的质量百分比分别为3%和6%；

d．在4000 r/min条件下离心处理，去除菌体，在上清液中加入硫酸铵，硫酸铵的饱和终浓度为60%，4℃静置过夜，在10000 r/min条件下离心处理30 min，将沉淀物用PBS缓冲液溶解后，再用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析4天，取透析袋中的物质冷冻干燥，得海胆源多粘芽孢杆菌抗肿瘤活性蛋白；SDS-PAGE电泳结果表明沉淀物为蛋白质。