[发明专利]一种杉木遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及杉木遗传转化方法，具体涉及一种以杉木悬浮细胞系为受体的农杆菌介导的遗传转化方法。

背景技术

杉木是我国特有的用材树种，是南方各省区最重要的造林树种之一。杉木生长快，产量高，性材好，用途多，木材销路好，其木材是优质的建筑材，装饰用材，是我国最重要的商品材树种。选育出生长速度快、繁殖力高、抗逆性强的杉木优株和无性系对林业生产具有十分重要的意义。

然而针叶树生长周期长、树体高大，而且由于长期异交，具有高度的杂合性和大量的遗传负荷。因此传统育种周期长，难以适应速生树木遗传改良的需要。林木遗传基因工程是林木生物技术的前沿领域，它不仅为林木遗传改良中的种质创新开辟了一条新的途径，同时也是研究基因功能的重要手段。将基因工程与常规育种技术相结合，可大大缩短林木育种周期，加速育种进程。

林木基因工程是通过适合的基因转移技术，导入有用的外源基因，获得转基因植株，进行林木遗传改良或有关的研究。近年来，林木基因工程取得了较大的进展。目前，已有几百种植物得到遗传改良，在丰产，抗病，抗寒等领域广泛应用。但在针叶树中却由于缺乏良好的转化方法和再生系统而受到严重限制。长期以来，人们认为根癌农杆菌的宿主主要为双子叶植物，但自从D.Cleene和D.Ley首次报道根癌农杆菌菌株B6也能感染裸子植物受伤组织，并产生冠瘿瘤后，许多学者开始利用根癌农杆菌进行裸子植物尤其是针叶树的基因转化的研究。并且已经证明外源基因在部分针叶树如白云杉、挪威云杉、火炬松及北美黄杉等的细胞组织中得到表达。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杉木遗传转化方法，以杉木悬浮细胞系为受体，进行农杆菌介导的遗传转化，以建立稳定高效的杉木遗传转化体系。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种杉木遗传转化方法，包括以下步骤：

（1）转化受体的建立：

取继代3周的杉木胚性愈伤组织细胞，接种到杉木液体培养基中，23℃，85r/min的恒温摇床振荡培养；每7天继代一次，第三次继代后3天后即可用于农杆菌侵染；其中，杉木液体培养基为DCR基本培养基，附加Vc 10 mg/L，GA 0.1-2 mg/L，ABA 2-5 mg/L，CH 0.5 g/L，麦芽糖30 g/L；

（2）农杆菌菌液制备：

活化EHA105菌液，挑取单菌落，再次活化，28℃、220r/min振荡培液体养至OD₆₀₀为0.6-0.8，用杉木液体继代培养基重悬菌体；

（3）侵染：

将菌液摇匀，取3mL菌液加到继代3天的杉木悬浮细胞中，静置1-3min后，置于23℃，85r/min的恒温摇床继续振荡培养16~36h； 

（4）脱菌培养：

用无菌水数次洗菌，用杉木液体培养基重悬杉木愈伤，将重悬后的杉木愈伤以铺平板的方式转移到加有头孢霉素500mg/L的体胚诱导培养基上，其中每皿4-5mL；并放入23℃恒温培养箱中暗培养。每隔21天继代一次，诱导30~60天；体胚诱导培养基为1/2DCR基本培养基，附加Vc 10 mg/L，GA 2-8 mg/L，肌醇5 g/L，CH 0.5 g/L，A C2 g/L，麦芽糖25 g/L，水晶洋菜2.8 g/L；

（5）筛选培养：

待杉木子叶胚成熟后，将其挑到加有200 mg/L 头孢霉素的DCR基本培养基上，23℃光照培养。培养21天后，转移到加有100 mg/L头孢霉素，20 mg/L卡那霉素的DCR基本培养基上进行筛选培养；每21天继代一次。

步骤（2）中，杉木液体继代培养基重悬菌体，菌液的OD₆₀₀为0.5。

步骤（4）中，无菌水中含有500mg/L头孢霉素。

所述的EHA105带有35S：GUS基因和NPT-Ⅱ基因。

步骤（5）中，继代2次后，就可用于移栽。

有益效果：与现有技术相比，本发明的杉木遗传转化方法，以杉木悬浮细胞系为受体，以GUS基因为报告基因通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，通过体细胞胚胎发生方式实现植株再生，建立起稳定高效的杉木遗传转化体系。利用本技术体系，可以以较低成本对杉木进行遗传改良，将基础理论研究中获得的抗病、抗逆、木材形成等相关的基因进行遗传转化，获得具有速生、抗病、抗逆性强等特点的优质杉木品种。

附图说明

图1是杉木胚性愈伤显微照片图；