[发明专利]一种携带TGF-βRⅡ和NKG2D基因的NK92细胞株、制备方法及用途

权利要求书

1.一种携带TGF-βRⅡ和NKG2D基因的NK92细胞株，其特征在于：所述的NK92细胞株转染有TGF-βRⅡ胞外段跨膜区和NKG2D胞内段构成的融合基因TN。

2.根据权利要求1所述的一种携带TGF-βRⅡ和NKG2D基因的NK92细胞株，其特征在于：所述的NK92细胞株的免疫表型为CD56强阳性、CD16阴性和CD3阴性，呈抱团悬浮生长状态。

3.根据权利要求2所述的一种携带TGF-βRⅡ和NKG2D基因的NK92细胞株，其特征在于：所述的融合基因TN位于重组慢病毒穿梭载体上。

4.根据权利要求3所述的一种携带TGF-βRⅡ和NKG2D基因的NK92细胞株，其特征在于：所述的重组慢病毒穿梭载体设有YFP筛选基因。

5.制备权利要求1-4任意一项所述的NK92细胞株的方法，包括如下步骤：a）克隆TGF-βRⅡ胞外段跨膜区和NKG2D胞内段构成的融合基因TN；b）构建重组TGF-βRⅡ胞外段跨膜区和NKG2D胞内段的慢病毒穿梭载体，联同包装载体转染293T细胞，获得慢病毒颗粒；c）转导NK92细胞；d）分选成功转染融合基因TN的NK92细胞。

6.根据权利要求5所述的NK92细胞株的制备方法，其特征在于，所述的步骤a具体为：提取人外周血淋巴细胞的总RNA，经RT-PCR获得cDNA，分别用两对引物经PCR扩增出TGF-βRⅡ胞外段跨膜区和NKG2D的胞内段两段基因，采用重叠延伸拼接PCR法将     TGF-βRⅡ和NKG2D基因连接成单链基因TN。

7.根据权利要求6所述的NK92细胞株的制备方法，其特征在于，所述的步骤b)具体为：将单链基因TN重组到质粒载体；将重组有TN的质粒载体及空载慢病毒穿梭载体酶切并连接，得到重组慢病毒穿梭载体；重组慢病毒穿梭载体联同包装载体△R、VSV-G、Rev通过磷酸钙法转染293T细胞，并培养一定时间。

8.根据权利要求7所述的NK92细胞株的制备方法，其特征在于，所述的步骤d具体为：培养经转导的NK92细胞并收集，通过流式细胞分选仪分选YFP阳性的细胞并进行优化培养。

9.权利要求1-4任意一项所述的携带TGF-βRⅡ和NKG2D基因的NK92细胞株的用途，其特征在于：靶向肿瘤微环境，抗肿瘤并抑制肿瘤扩散。

10.权利要求9所述的携带TGF-βRⅡ和NKG2D基因的NK92细胞株的用途，其特征在于：在TGF-β作用下，所述的细胞株的激活程度增加。