[发明专利]一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法

权利要求书

1.一种快速鉴定鸭甲肝病毒血清型的双重RT-PCR方法，其特征在于包括以下步骤：

A、通过对参考GenBank上已发表的DHAV-1和DHAV-3的序列进行比对，选择在DHAV-1和DHAV-3的多聚蛋白基因polyprotein gene的保守区分别设计一对针对DHAV-1的特异性引物SEQ1/SEQ2和一对针对DHAV-3的特异性引物SEQ3/SEQ4；

SEQ1：5’-CAA CTC GAC CAA TH(T/C/A)C CTG G-3’，

SEQ2：5’-CCT GR(A/G)T GR(A/G)A CCA TTG TR(A/G)A CTG-3’，

SEQ3：5’-GAA ATC TGC ACT CAA TGG AGA G-3’，

SEQ4：5’-CCC AGG AAA TGA TTG GTC AG-3’；

所有引物以无菌ddH₂O配成25pmol/μl的浓度备用；

B、常规方法提取待测鸭肝组织总RNA作为模板，进行反转录反应；反应体系为：模板RNA4μl，SEQ1和SEQ3引物各1μl，5×M-MLV Buffer2μl，浓度为10.0mM dNTPs0.5μl，Rnase Inhibition0.25μl，浓度为5U/μl RTase M-MLV0.5μl，ddH₂O0.75μl；反应程序为：42℃保存60min，70℃15min，获得病毒cDNA；

C、以病毒cDNA为模板进行PCR反应；反应体系为：35.1μl ddH₂O，5μl Buffer，浓度为10.0mM dNTPs3μl，SEQ1和SEQ2各1.2μl，SEQ3和SEQ4各1.0μl，2μl cDNA模板，0.5μl Taq酶；PCR反应条件为：95°C5min；95°C50s，60°C50s，72°C40s，30个循环；72°C10min；

D、对步骤C得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。