[发明专利]鉴别中国与欧洲牛肝菌的分子特异性标记引物及方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种鉴别中国牛肝菌Boletus roseoflavus与欧洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对中国与欧洲牛肝菌标本进行快速辨别的方法。

（二）背景技术

Boletus roseoflavus和B.appendiculatus均隶属于牛肝菌目Boletales下Boletus属的Appendiculati Konrad & Maubl.ex Lannoy & Estadès类群。到目前为止，仅发现B.roseoflavus分布于中国，B.appendiculatus分布于欧洲。中国B.roseoflavus的鉴别特征为菌盖淡粉红色、紫红色、玫瑰红色，菌肉暴露在空气中不变蓝，或缓慢变蓝，菌孔受伤后立刻变蓝，担孢子的平均长宽比小于3。欧洲B.appendiculatus的鉴别特征为菌盖浅色到深褐色，不带有粉红色彩；菌肉暴露在空气中显著变蓝，菌孔受伤变蓝；担孢子的平均长宽比小于3。这二个种在菌盖颜色上存在明显差异，但子实体形态特征较为相似，菌肉、菌孔的变色反应也很接近。自2005年以来，分布于浙江的B.roseoflavus标本被我国的菌物学家错误地冠以了欧洲B.appendiculatus的种名，国内一些文献对此有过记载。事实上，B.roseoflavus与B.appendiculatus并非同种，迄今在中国尚未发现有真正的B.appendiculatus存在，这一结论后来也得到了分子数据的支持。

对B.roseoflavus与B.appendiculatus这二个相似种辨别的主要特征是宏观上的子实体颜色差异和变色反应以及生境。但由于颜色差异易受生境、气候、土壤、子实体生长期、生理状况等的影响而常常导致主观判别上的偏差，而对于长期保藏的干标本，特别是对古老标本、模式标本的重新鉴别研究，仅凭颜色差异更是难以准确鉴定。因此，在大型真菌分类研究上，分子技术已成为了对标本辅助鉴定的重要手段。

真菌的核糖体基因rRNA的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer,ITS）的保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显，这一特点使得ITS区段不仅适合于属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析，而且非常适合于真菌物种的分子鉴定。对B.roseoflavus和B.appendiculatus的ITS区测序结果显示，B.roseoflavus和B.appendiculatus的ITS1-5.8S-ITS2序列长度分别为690-706bp和600-690bp，很难利用通用引物对（如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4）的PCR扩增、普通电泳来进行准确辨别。对这二个相似种的ITS序列比对显示二者的局部序列存在较大差异，这为设计ITS特异引物，针对性地扩增ITS特异片段，以方便用于这二个相似种的分子辅助鉴定提供了可能性。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种可鉴别中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特异性标记引物，以及一种利用该引物对中国和欧洲牛肝菌进行快速辨别的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种鉴别中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5′-CTTGCTCAGCCCAACTCAACG-3′

下游引物：5′-ATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACG-3′

该引物对是采用PCR技术，经过对中国牛肝菌标本B.roseoflavus和欧洲牛肝菌标本B.appendiculatus的核糖体基因ITS区序列的克隆测序，以得到的ITS序列进行碱基差异比对，并以此设计ITS特异性引物对。以该引物对B.roseoflavus和B.appendiculatus标本进行PCR扩增，可从B.roseoflavus中获得625bp大小的特异性片段。

本发明还涉及所述的分子特异性标记引物在鉴别中国牛肝菌B.roseoflavus和欧洲牛肝菌B.appendiculatus中的应用。