[发明专利]表达副猪嗜血杆菌表面抗原的猪霍乱沙门氏菌减毒疫苗

说明书

技术领域

本发明属于动物细菌性疾病基因工程疫苗领域，具体涉及一种无抗性标记表达副猪嗜血杆菌表面抗原基因的重组猪霍乱沙门氏菌减毒疫苗菌株的构建、疫苗制备以及应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是常规饲养猪群上呼吸道中的一种常在菌，但在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征(，1910)。近年来鉴于饲养技术的不断调整以及新型呼吸道综合征的不断发生，副猪嗜血杆菌病日趋流行，对国内外养猪业造成了巨大危害。现今副猪嗜血杆菌病的主要防制手段是药物控制和疫苗接种。但是抗生素的长期添加和不合理使用势必会导致耐药菌株不断增多、耐药谱日益扩大以及严重的药物残留，对食品安全和人类健康造成严重威胁(周学利，2009)。商用灭活苗和自家苗可在一定程度上控制副猪嗜血杆菌的感染，然而血清型多样性以及占很大比例的不能分型菌株影响了商品苗的防制效果，因此常常在大规模免疫时失败。自家苗的保护可能更有针对性，但也经常因为分离到的副猪嗜血杆菌不是真正的致病菌株或不是主要致病血清型而造成免疫无效。

近年来基因工程产业飞速发展，使得疫苗的研发无论在方法上还是在观念上部发生了重大转变。当前应用基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制多联活疫苗等已成为研究热点。研究表明减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有诸多优点：具有联合免疫作用，可以稳定表达外源基因，且载体疫苗本身不致病，却可作为仔猪副伤寒活疫苗；通过自然感染途径如口服或鼻内接种，可以激发机体的系统免疫和粘膜免疫反应；减毒沙门氏菌可侵入淋巴系统，能更有效激发宿主的体液免疫和细胞免疫，并可产生细胞毒性T细胞杀伤反应；所表达靶抗原无需提纯，可直接用于动物体免疫保护，显著降低疫苗制作成本；另外具有载体菌的免疫佐剂作用、减毒活疫苗的免疫持续性等特点。

20世纪60年代初，中国兽药监察所房晓文等将猪霍乱沙门氏菌强毒株接种含醋酸铊的培养基中传数百代后筛选出一株免疫原性好的弱毒株，命名为猪霍乱沙门氏菌C500。后来该菌株在全国推广使用，使我国仔猪副伤寒得到有效控制。如今人们已经研制出多种不含抗生素抗性标记的沙门氏菌疫苗系统，其中应用最广的是asd质粒载体平衡致死系统。沙门氏菌asd(aspartate semialdehyde dehydrogenase)基因编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶，该酶是二氨基庚二酸(DAP)生物合成途径中的必需酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个重要组分。asd基因缺失株在无外源DAP条件下不能形成完整细胞壁导致溶菌死亡。将目的基因插入含asd的转移质粒，转化至asd^-受体菌后形成互补，asd^-沙门氏菌在动物体内不能生存，只有含asd转移质粒的重组沙门氏菌才能存活，并可稳定地在体内体外表达外源抗原。由于以asd质粒载体平衡致死系统代替抗生素抗性标记，因此应用起来也更加安全。

鉴于猪霍乱沙门氏菌asd质粒载体平衡致死系统具有外源基因表达稳定、不需纯化、无抗生素抗性标记等诸多优点，同时基于副猪嗜血杆菌外膜蛋白HbpB的良好免疫原性，将猪霍乱沙门氏菌C500菌株开发为能够表达副猪嗜血杆菌保护性抗原基因HbpB的重组弱毒活疫苗具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有技术缺陷获得一种免疫原性佳和安全性好的可以表达副猪嗜血杆菌HbpB抗原的重组猪霍乱沙门氏菌菌株。

本发明的第二个目的是利用表达副猪嗜血杆菌HbpB基因的重组猪霍乱沙门氏菌菌株制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗。

本发明的第三个目的是利用表达副猪嗜血杆菌HbpB基因的重组猪霍乱沙门氏菌菌株制备的猪霍乱沙门氏菌副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人获得了一株不含抗性标记的表达副猪嗜血杆菌HbpB基因的重组猪霍乱沙门氏菌株，命名为猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-HbpB，Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA-HbpB，于2013年1月24日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2013052。

本发明主要技术路线涉及如下方面：