[发明专利]耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法

说明书

技术领域

    本发明属于生物技术领域，具体为耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法。

背景技术

耐冬山茶为第三纪的残遗植物种类，因地壳运动，使得青岛耐冬与外界山茶基因交流甚少，从而保留了古老而独具特色的遗传特性。从观赏角度而言，耐冬山茶花色艳丽，花型优美，为青岛市花；同时，其叶茎花亦可入药，用于预防和治疗多种疾病，极具医疗应用前景；不仅如此，耐冬山茶还具有很强的CO₂吸收能力，且对H₂S等有害气体具有较强的抗性，故亦具有净化空气等环保作用，可谓全身是宝。

目前生产上使用的种苗仍是以传统方式培育为主。然而，山茶的生长速度慢，繁殖系数低，靠嫁接、扦插等传统方式培育，完全不能满足市场的需求。而关于山茶属植物的组织培养，国内从20世纪80年代开始就有诸多研究工作，并取得了可喜的进展。采用山茶种子的子叶、幼龄山茶花的茎尖与带芽茎节、成年山茶花的茎尖与带芽茎节等，作为外植体均可获得再生植物。现阶段通过“芽生芽”这种茎段培养的方式得到耐冬山茶的例子已有，而对于耐冬山茶由愈伤组织诱导到不定芽分化的例子却鲜有报道，也未见专利申请。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法的技术方案，采用该方法繁殖系数较高，周期较短，同时也为山茶分子育种奠定基础。

所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）采集9月初的耐冬山茶果实，剥去果皮，用洗涤剂搓洗种子，再用自来水搓洗至无泡沫，置于培养瓶中，加入75%酒精进行第一次消毒清洗8-12秒，然后纯净水清洗2-3遍，沥干水分，盖上瓶盖，置于无菌超净台备用；

2）再次使用75％酒精对种子表面消毒25-35秒，接着使用0.1％HgCl₂浸泡6-10分钟，然后用无菌水冲洗5-6遍，清洗完毕后将种子铺在放有过滤纸的平皿里吹干水分，备用；

3）剥去种子的内外种皮，接种于愈伤诱导培养基上，培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000 Lx，光照时间为10-12h/d；所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg?L^-12,4-D 和 1.8-2.2 mg?L^-1 6-BA，愈伤诱导培养基中蔗糖含量为2-4%，琼脂0.6-0.8%，灭菌前将PH调至5.7-5.9，120-125℃下灭菌20-25分钟；

4）材料接入愈伤诱导培养基后15-18天后开始启动，待第25-28天的时候诱导出的细密的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的一圈，淡黄色，泛着些许绿色、晶莹、剔透，这时再将长有愈伤组织的材料转移至愈伤组织过渡培养基上，培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000 Lx，光照时间为10-12h/d；所述的愈伤组织过渡培养基为MS基本培养基中加入0.1-0.15 mg?L^-1NAA + 2.0-2.2 mg?L^-16-BA；

5）材料在愈伤组织过渡培养基内进行培养，待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内，培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000 Lx，光照时间为10-12h/d；所述的愈伤组织分化不定芽培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg?L^-1NAA + 9-11 mg?L^-1 6-BA或者MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg?L^-1IBA + 9-11 mg?L^-16-BA；

6）材料成型并长至3-4cm的芽条，其基部用500-550mg?L^-1的IBA浸没处理20-25min，然后转到MV液体培养基的纸桥上在100-200 μmol?m^-2?s^-1下诱导生根；诱导生根阶段，采用MV液体培养基加入蔗糖15-20 g?L^-1，20-22天开始启动，透明略带红色的幼根长出，再培养一段时间之后，幼根伸长并逐渐木质化。

所述的耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法，其特征在于步骤1）中：第一次消毒清洗时间9-10秒。