[发明专利]一种副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程苗

权利要求书

1.一株表达副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因的重组的猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA，Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA-PalA，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2013053。

2.如权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA，其特征包括：

1)所述的菌株基因组缺失了猪霍乱沙门氏菌生长必需的asd基因；

2)所述的菌株内含表达副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因的重组质粒pYA-PalA，该质粒能够复制表达asd基因。

3.一种无抗性标记的重组质粒pYA-PalA，其特征在于，所述的质粒含有副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因，且能在宿主菌内表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一种无抗性标记的重组质粒pYA-PalA，其蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种表达副猪嗜血杆菌表面抗原基因PalA的重组的猪霍乱沙门氏菌的制备方法，其包括如下步骤：

1)构建猪霍乱沙门氏菌C500菌株asd基因缺失株asd^-C500；

2)设计引物对，通过PCR扩增方法得到副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

3)将步骤2)中扩增的基因片段PalA插入原核表达载体pYA3493的EcoR I和Sal I位点之间，得到表达质粒pYA-PalA；

4)将步骤3)获得的表达质粒pYA-PalA电转化至宿主菌株猪霍乱沙门氏菌asd^-C500中，筛选得到表达副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因的重组的猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA，Salmonella choleraesuis)asd^-C500/pYA-PalA，其保藏号为CCTCC NO：M2013053；

其中：

步骤2)所述的引物对的DNA序列如下所示：

上游引物：gaa gaattc agtgctaatgcaagtgctaatgcagg，

下游引物：agtgtcgac_ttagtactctaacactgcacgacggttt。

6.权利要求1或2所述的重组的猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗中的应用。

7.权利要求3或4所述的重组质粒pYA-PalA在制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗中的应用。