[发明专利]一株用于面包发酵的耐冷冻酵母菌株及其选育方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一株用于面包发酵的耐冷冻酵母菌株及其选育方法。

背景技术：

冷冻面团技术是面包生产的一种新工艺，是将面包生产中的面团制作和烘烤两个环节相分离的过程。与传统面包制作法相比，冷冻面团法具有生产效率高、面包质量稳定、方便快捷等优点。但面团冷冻时，温度一般为18～-20℃，面团中的酵母在冷冻、冻藏和解冻过程中都会受到严重伤害，尤其是发酵后的面团经过冷冻工序后，酵母的存活率和产气能力显著下降。普通面包酵母冻存20天后，活力下降一半以上，导致解冻后的面团膨胀不足，醒发时间延长，且成品面包体积小、结构粗糙、口感差，产品质量明显下降。正是这些缺陷的存在，限制了冷冻面团技术的发展。在我国，对于冷冻面团的工艺研究较多，但有关面包酵母耐冷冻机制和菌种选育的研究较少，特别是在耐冷冻酵母产品方面还是一个空白，不仅制约了酵母工业的发展，同时也制约了冷冻面团技术在我国的推广应用。耐冷冻面包酵母的研究是冷冻面团技术在国内发展的潜力所在。

海藻糖是一种细胞在应对环境变化而合成的具有高抗性的物质，是生物体内的一种典型的应激代谢物。酵母的耐冻性与前发酵期开始时胞内海藻糖基本含量相关，海藻糖能保护细胞免受冻伤。目前普遍认为，海藻糖是面包酵母耐冷冻性的主要机制，胞内海藻糖含量越高，酵母耐冷冻能越好。增加胞内海藻糖含量是提高面包酵母耐冷冻性能的一种重要途径。

酵母海藻糖的分解代谢是在两类海藻糖酶的作用下进行的，它们是分别由ATH1基因编码的酸性海藻糖酶(Ath1)和由NTH1和NTH2基因编码的中性海藻糖酶(Nth1和Nth2)。在胞内海藻糖的分解代谢中，中性海藻糖酶Nth1起主要作用。海藻糖的合成酶比较复杂，6磷酸海藻糖合成酶(T6ps)和6磷酸海藻糖磷酸脂酶(T6pp)被认为是两个最重要的合成酶，分别由TPS1和TPS2编码，其中6磷酸海藻糖合成酶基因TPS1是催化海藻糖合成的关键基因。因此，为了提高面包酵母耐冷冻能力，可通过敲除海藻糖分解酶基因和过表达海藻糖合成酶基因提高面包酵母胞内海藻糖含量以增强细胞的耐冷冻性能。

发明内容：

本发明的目的是提供一株用于面包发酵的耐冷冻酵母菌株及其选育方法。

本发明提供的酵母菌株是具有耐冷冻性能的酵母菌株，具体为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BTN。该菌株已于2013年1月18日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.7151。

所述酵母菌株具体可以通过敲除出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的中性海藻糖酶编码基因的部分或全部序列，并同时用强启动子过表达6磷酸海藻糖合成酶编码基因来实现。

本发明所提供的构建上述酵母菌株BT-N的方法是，将PCR扩增重组质粒得到的重组基因盒(是否多一个盒字？导入出发菌株酿酒酵母中通过同源重组获得重组菌。

所述的重组质粒，是能够完全敲除酿酒酵母的中性海藻糖编码基因并同时过表达6磷酸海藻糖合成酶编码基因的重组质粒pUC-TNBAK。

所述中性海藻糖编码基因为NTH1基因，所述6-磷酸海藻糖合成酶编码基因为TPS1基因。

所述重组质粒上无任何营养缺陷型筛选标记。

所述中性海藻糖编码基因NTH1的GeneID为：851564；6磷酸海藻糖合成酶编码基因TPS1的Gene ID为：852423。

所述酵母菌株在其它发酵性能不受影响的情况下，在-20℃冷冻21d后的细胞存活率为92.75％，相对发酵力为53.24％，与出发菌株(冻存活率为35.36％，相对发酵力为28.46％)相比，分别增加了57.39％和24.78％。

本发明同时提供了一种专门用于鉴定所述耐冷冻酵母菌株的基因序列，该基因序列是分别用N-S/K-S和PT-X/N-X2两对引物以所述耐冷冻酵母菌株基因组为模板扩增得到的片段，其序列如序列表1和序列表2所示。

有益效果：