[发明专利]小鼠抗人EGFR单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及以原核表达的EGFR蛋白免疫小鼠获得的分泌EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞株11B2，属于生物工程技术领域。 

背景技术

EGFR(表皮生长因子受体)也称作erbB1/HER1是由1186个氨基酸残基构成，分子量约为170kDa的一种跨膜糖蛋白。EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，该基因定位于人7p12.1～13.2。EGFR属于表皮生长因子受体(HER)家族成员，目前已知该家族包括四个相关的蛋白酪氨酸激酶受体：HER1(erbB1/EGFR)、HER2(erbB2/NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)，这些蛋白酪氨酸激酶受体在细胞表面与特异的天然受体或生长因子相互作用。 

EGFR广泛分布于哺乳动物的上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞中。在包括非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、结肠癌、食道癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌等多种上皮来源的肿瘤中，EGFR存在高表达或变异。EGFR高表达水平与肿瘤的恶化、易侵袭性、对放化疗的抵抗程度密切相关，在很多恶性肿瘤中也与不良预后相关。 

EGFR在调节肿瘤细胞的增殖、存活、损伤修复、粘附、转移及新血管生成中具有重要的作用，其致瘤效应包括DNA合成启动和促进细胞生长、侵袭及转移等。EGFR由胞外配体结合区、疏水性跨膜区和胞内酪氨酸激酶区三部分组成，以无活性的单体形式存在，其特异性配体有EGF、转化生长因子α(TGF-α)、双向调节因子以及肝素结合EGF样生长因子。当EGFR胞外区与配体结合后，其胞内区发生自身磷酸化，导致EGFR二聚化，激活胞内酪氨酸酶活性，使下游一系列胞内信号分子发生磷酸化，从而启动Shc，Ras/MARK，PI3K及JAKs/STATs等多条通路。EGFR信号通路的活化可以增加肿瘤细胞的侵袭力、使肿瘤细胞增值、促进血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡。EGFR在肿瘤细胞中的高度表达以及在肿瘤细胞生长、分化等生理过程中发挥的重要作用使EGFR成为具有良好前景的肿瘤诊断及治疗的靶点。 

目前，国内外已经获得了多种EGFR的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的EGFR的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测EGFR表达的 小鼠抗人EGFR单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案： 

(1)根据EGFR的基因序列(NM_005228.3)的编码框，设计一对特异引物，Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增EGFR基因，构建重组表达载体PET28a-EGFR，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。 

(2)采用经典的细胞融合技术制备EGFR单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。 

(3)采用免疫印迹法(Western blot)检测EGFR单抗的效价及特异性，通过免疫组织化学分析EGFR单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。 

(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体EGFR重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体EGFR的重链和轻链可变区序列。 

本发明提供的以原核表达的EGFR蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌EGFR单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为11B2，分类命名为小鼠抗人EGFR杂交瘤细胞系，该细胞株11B2已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.6912。 

本发明还提供了所述杂交瘤细胞株11B2，CGMCC No.6912产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：10。