[发明专利]生物还原制备他汀侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯及菌株

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一株具有反-Prelog非对映体选择性羰基还原酶活性的菌株——黏红酵母（Rhodotorula glutinis）ZJB-09224，及其在生物不对称还原制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

（二）背景技术

心血管疾病已成为对人类最具威胁的疾病之一，其发病率和死亡率均已超过恶性肿瘤而跃居第一。据世界卫生组织统计，全世界每年有3000多万人死于心脑血管疾病，约占全部死亡人数的一半。中国每年因心脑血管疾病及并发症死亡病例超过300万。研究表明，血脂异常引发的大动脉和中型动脉粥样硬化是心脑血管疾病的最主要病因。人体高血脂症主要是极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）增多，临床上血清胆固醇含量高于2.30g/L、甘油三酯高于1.40g/L统称为高血脂症。调节血液中脂蛋白的比例并维持在相对恒定的浓度，是预防和消除动脉粥样硬化的关键。人体内的胆固醇主要来自于肝脏内源性生物合成，肝脏细胞细胞质中胆固醇合成途径需要26步生物合成反应，其中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）还原酶催化HMG-COA还原生成甲羟戊酸反应是人体内胆固醇合成的限速性步骤。

他汀类药物是HMG-COA还原酶的竞争性抑制剂，能强烈抑制人体内胆固醇的合成。此外，他汀类药物还能反馈性上调细胞表面低密度脂蛋白受体表达，促进循环血液中极低密度脂蛋白胆固醇残粒和低密度脂蛋白的清除，最终降低血清中总胆固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止动脉粥样硬化和冠心病的发生，产生较好的降血脂疗效。全球开发和在研的他汀类药物已有十多个品种。第一代他汀药物包括辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀，是一类结构类似的真菌代谢物。第二代他汀包括化学合成的外消旋氟伐他汀。第三代他汀是合成的光学纯他汀药物，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。他汀类降脂药占世界降脂药物市场的85%以上份额，并仍具有提升空间。2003年，阿托伐他汀成为全球首个年销售额超过百亿美元的药物，近年来的销售额仍稳居世界前列。国内他汀类药物市场前景广阔。

他汀类药物往往都含有3,5-二羟基己酸酯侧链结构，该结构含有两个手性中心，只有一种立体异构体（(3R,5R)-或者(3R,5S)-二羟基己酸酯）具有HMG-COA还原酶抑制活性。由于各国药监部门要求药物e.e.值大于99.5%，d.e.值大于99%，他汀类药物的手性侧链的光学纯度将决定药物的质量。作为他汀类药物的关键合成砌块——6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯生产技术备受关注。广泛采用的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成方法存在诸多缺陷，合成需要使用剧毒的三乙基硼和-85℃深冷条件，而且非对映诱导不充分，产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯d.e.值低，该反应形成的硼化物废物处理需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏等。与化学合成方法相比，生物催化法制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯具有许多不可比拟的潜在优势，包括反应体选择性高，反应条件温和，革除有毒溶剂使用等等。迄今为止，文献报道的具有不对称还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯活性的微生物菌种有Beauveria bassiana ATCC 7159、Hansenula nonfermentans CBS 5764、Saccharomyces cerevisiae，Pichia angusta NCYC 495、Pichia angusta NCYC R320、Pichia angusta NCYC R322、Pichia haplophila CBS 2028、Pichia pastoris BPCC 260、Pichia pastoris BPCC 443、Pichia pastoris NCYC R321、Pichia membranefaciens、Pichia guilliermondii、Candida humicola CBS 1897、Candida solani CBS 1908、Candida diddensiae ATCC 20213、Candida friedrichii ATCC 22970、Kluyveromyces drosophilarum CBS 2105、Torulaspora hansenii ATCC 20220。目前，未见Rhodotorula glutinis具有(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯非对映选择性(R)-羰基还原酶活性的报道。

（三）发明内容