[发明专利]粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及其突变体(mG-CSF)与人血清白蛋白第三结构域(3DHSA)的融合蛋白及应用

说明书

技术领域

本发明属长效融合蛋白药物技术领域，具体是涉及制备粒细胞集落刺激因子及其突变体与人血清白蛋白第三结构域的融合蛋白。

背景技术

人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是由单核细胞、纤维母细胞、内皮细胞产生的一种分子量约为20KD的糖蛋白类调节因子，其等电点约为6.0。G-CSF作用于骨髓中性粒细胞系造血前体细胞，促进其增殖、分化、成熟和释放。成熟人体内G-CSF有177个氨基酸(a型)和174个氨基酸(b)型两种异构体，b型分子的螺旋含量很高，晶体构型含有四个α螺旋，属于长链螺旋细胞因子家族。鉴于b型的生物学活性及稳定性均显著高于a型，b型分子深受研究者的推崇。重组人G-CSF已广泛用于骨髓移植和肿瘤的治疗，此外，重组人粒细胞集落刺激因子还被用于治疗急性白血病、再生障碍性贫血等疾病。G-CSF在辅助肿瘤治疗方面的作用主要是增加白细胞数目，降低化疗和放疗的风险。目前已有多种以b型为基础的重组人粒细胞制剂被批准上市，如非格司亭(filgrastim)，来格司亭(lenograstim)，那托司亭(nartograstim)。其中非格司亭和那托司亭为大肠杆菌表达的非糖基化形式的重组人G-CSF，而来格司亭是CHO细胞表达的带糖基化修饰的G-CSF。非格司亭氨基酸序列即在天然G-CSF的N端附加一个蛋氨酸，那托司亭为非格司亭的突变体，共涉及天然G-CSF中5个氨基酸的定点突变，具体突变位点及方式为Thr 1 Ala，Leu 3 Thr，Gly 4 Tyr，Pro 5 Arg，Cys 17 Ser。

但是，天然和基因重组的人G-CSF易被肾小球滤过和体内蛋白酶降解，在体内的循环半衰期比较短，生物利用度非常低，为维持发挥作用的药效浓度需要频繁或高剂量给药，增加了患者的疼痛和经济负担。因此，延长粒细胞集落刺激因子的半衰期是目前各国学者研究的重点。为延长粒细胞集落刺激因子的体内半衰期，可对其进行特定修饰。一种途径是通过与某些特定组分耦联达到增加G-CSF表观分子量，从而降低肾脏的清除率。另一种途径是与惰性蛋白融合，在受体介导的内吞作用保护下阻止蛋白酶与蛋白的接触，从而降低G-CSF被体内蛋白酶降解的风险。通过聚乙二醇修饰、抗体Fc片段融合及白蛋白融合均可有效改善G-CSF的体内半衰期。但是，聚乙二醇化修饰需要特殊的化学试剂，产物均一性差，分离纯化困难，造成产品的价格昂贵。为保证Fc融合蛋白二硫键的正确折叠需要选用成本很高的哺乳动物表达系统，另外，Fc融合蛋白的分子量偏大易造成融合蛋白分子扩散通过粘膜的速率较低，进而影响药效。

人血清白蛋白是人血浆中的主要成分，具有维持血浆渗透压的功能，同时充当内源和外源多种物质或药物载体的作用。一方面由于其分子量比较大，正常情况下不易被肾小球滤过，另一方面可与体内新生的Fc受体(FcRn)结合，通过受体介导的内吞作用耐受体内蛋白酶的降解，其体内半衰期为19天。基于白蛋白的上述特点，美国人类基因组科学公司首先开发了白蛋白融合技术，目前已有多种白蛋白融合蛋白药物处于临床实验阶段。

虽然白蛋白融合技术已成功应用于延长多种蛋白或多肽类药物分子的半衰期，但是仍有一些亟待改进的方面。首先，由于白蛋白分子量约为66.5KD，在融合其他蛋白或多肽时会产生明显的空间位阻作用导致融合蛋白的活性明显降低。其次，在酵母分泌表达白蛋白及其融合蛋白时易发生降解现象，且降解片段理化性质与融合蛋白十分相近，增加了后续分离纯化的难度。最后，白蛋白融合蛋白在储存的过程中容易发生聚合现象，临床应用中容易诱发免疫反应。

已有研究证实人血清白蛋白的第三结构域(3DHSA)是人血清白蛋白与FcRn结合的关键部位，独立的3DHSA仍然具有与FcRn结合的能力，其作为伴侣分子能够延长药物半衰期。此外，在表达人血清白蛋白第三结构域时未见降解现象，且其分子量大小适中，便于基因操作，较白蛋白融合更便于满足延长不同分子半衰期的需要。利用重叠延伸PCR(Over lapping PCR)方法，将3DHSA与效应分子进行直接融合，一方面可有效降低融合时产生的空间位阻效应，另一方面避免因连接肽的引入所导致降解和潜在免疫原性等问题。

基于上述的理论与实践可以推测，将G-CSF及其突变体与3DHSA融合时所构建的蛋白将同时具有G-CSF与3DHSA的双重生物学活性，可用于中性粒细胞减少症的治疗，并延长G-CSF的体内半衰期。

发明内容