[发明专利]一种产表面活性剂的烃降解菌的改良方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产表面活性剂的烃降解菌的诱变改良方法，属于环境生物工程和环境微生物技术领域。 

背景技术

石油污染问题引起了人们越来越多的关注。石油污染环境的修复有物理、化学和生物修复等三种方法。微生物修复技术是生物修复中最重要、最核心的组成部分，具有成本低、应用方法简单、污染物氧化完全、无二次污染、可原位处理、不需大型设备等优点，日前引起重视，每年新发表公布的论文成果层出不穷。 

微生物修复的关键技术是选用高效的石油烃降解菌株。修复工作中应用的烃降解菌株的获得目前多局限于天然分离和筛选，主要在被石油污染的水环境和土壤环境中采样。由于野外环境复杂恶劣，用于烃污染修复的天然分离的菌株往往满足不了要求。因此筛选和改良烃降解菌就显得至关重要。其中方法之一是用基因工程的手段，对天然降解性质粒进行转移来构建新功能菌株，但此种方法需要较高的技术条件，同时工程菌的在环境中的释放和应用受到严格的限制；另一种方法是用物理的、化学的和生物的方法进行诱变，目前多用紫外线和γ射线进行诱变，效果有限。寻找更有效的诱变源，就成为解决问题的关键之一。各种电离和非电离辐射是较常用的诱变源，低能离子束是一种新型、高效的电离辐射诱变源，而紫外线则一种经典的非电离辐射诱变源。低能离子束诱变育种需要较昂贵的专用仪器设备，且维护费用较高，在一定程度上影响了其发展应用。紫外诱变操作简单，成本低廉，效果较好，因此应用广泛。 

以上两种物理诱变剂各有优缺点，应结合应用。但将二者结合应用的报道很少。 

平板筛选是诱变育种程序中最重要的一环，高效的平板初筛方法，对提高筛选效率、降低筛选劳动强度具有积极意义。但产表面活性剂的烃降解菌如何进行进行筛选，以获得表面活性剂发酵产量与烃降解效率的同步提高，没有权威报道，血平板和油平板制作技术要求高，成功率低，已有文献均报道不详。 

发明内容

本发明提供一种产表面活性剂的烃降解菌的改良方法，具体步骤如下： 

(1)菌种活化：取保藏菌种的甘油管，加入含有50mL肉胨培养基的250mL摇瓶中，30℃振荡培养1-2天，直到培养出现明显的浑浊为止； 

(2)平板培养：取摇瓶培养物以10倍稀释法稀释成10^-1-10^-6，取适宜稀释倍数的菌液涂布于肉胨平板； 

(3)斜面培养：平板培养后检查菌落的一致性，确定为纯培养后，接种于肉胨斜面(采用15mL试管配制)，30℃条件下培养1-2天，至斜面找出菌苔为止； 

(4)制作菌悬液：取新培养的斜面，加入无菌生理盐水(0.86％)5mL，振荡1-5分钟，使菌苔中的菌体脱落成菌悬液； 

(5)涂布菌悬液：在超净工作台中，取上述0.1mL菌悬液，添加于灭菌的90mm培养皿下盖中，用涂布棒涂匀； 

(6)制作菌膜：在超净工作台中，打开培养皿上盖，开无菌风吹5-10min，至培养皿下盖中无水珠为止，使之形成干燥的菌膜，吹风时间过短菌膜不干，易在下一步的离子束注入过程中不易形成真空环境，影响离子束诱变效果，吹风时间也不宜过长，容易造成自然对照和真空对照菌落过少，不易统计相对存活率； 

(7)离子束注入：吹干形成菌膜后，合上培养皿，立刻将培养皿置离子束注入机小靶室中，取出上盖，封闭小靶室，抽真空至一定真空度后，按事先设计好的离子种类、能量和剂量进行注入，一般选用15-20keV氮离子，设定自然对照和真空对照，菌膜形成后立刻进行下一步即为自然对照，将培养皿放入小靶室中但放于辐照的培养皿下面不开盖即为真空对照； 

(8)菌膜洗脱：所有的培养皿盖上上盖，取出培养皿，用1.5mL生理盐水用移液枪和涂布棒配合使用分两次洗脱菌膜，转移至1.5mL无菌离心管中； 

(9)平板培养：上述菌悬液摇匀后，梯度稀释到10⁶倍后视实际情况取适宜倍数涂布于肉胨平板上，肉胨培养基成份为(/L)：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，纯净水或自来水1L，调pH至7.0左右，配制平板时要加1.5％的琼脂粉，30℃倒置培养2天后统计菌落数，将各剂量处理均与真空对照相比，求得相对存活率，将真空对照与自然对照的相同稀释倍数的菌落数相比，即得真空对照的存活率；