[发明专利]实时荧光定量检测厌氧环境中地杆菌属微生物丰度的引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种实时荧光定量检测环境微生物地杆菌属丰度的引物和探针，特别是用于地杆菌属的实时荧光定量PCR检测，属于环境生物技术领域。

背景技术

地杆菌属(Geobacter)是一类特殊的严格厌氧呼吸的环境微生物，是人类发现的第一种能够利用氧化铁或其他金属的氧化物作电子受体进行无氧呼呼以获取能量的微生物。地杆菌在地层深处、地下水层、淤泥层等大量存在，甚至是优势菌种。因此，对于清除厌氧环境中有机污染(如原油、多环芳烃等)以及放射性金属(如铀等)具有重要意义，而且在无氧呼吸的过程中产生电流，因此也是微生物燃料电池研究的热门菌种之一。

地杆菌之所以能利用金属氧化物进行无氧呼吸，与其能产生菌毛(pilus)促进菌体与金属氧化物之间的电子传递有密切联系，因此也称纳米天线。

在地下水层或水体沉积物污染原位生物修复或实验室模拟研究中，地杆菌丰度是监测修复效果的重要依据之一。由于地杆菌多数菌种不可用常规方法培养，研究受到局限。但采用实时荧光定量PCR(q-PCR)技术，则有效地克服了培养上的障碍，成为一种高效、精确监测厌氧环境中地杆菌丰度的新技术。

实时荧光定量PCR成败的关键技术之一是找到定量群体存在2个或3个以上保守区域的基因，根据保守区域设计出引物，结合扩增体系和程序的优化，方能取得良好的效果。

尽管其他属菌种也有菌毛，但多不具备电子穿梭的功能，因此可以推测地杆菌与菌毛相关的基因可能具有特异性，满足以上要求。

针对文献中对该菌的定量测定中的引物和探针序列已经不能覆盖GeneBank中的地杆菌属新出现的菌种和菌株的序列这一问题，本发明提供了对地杆菌属进行定量PCR检测所需的引物对和分子信标探针序列，有助于有效进行环境中地杆菌的定量和监测。

发明内容

本发明提供的一种实时荧光定量检测环境微生物地杆菌属丰度的引物和探针，其特征是：

引物1：F4525′-ACCGGACCTGCAACATCATCACC-3′

引物2：R10575′-CATCGACGACAAGGAGAAG-3′

分子信标探针：5’-FAM-GGAGGTGGAAGAGATGCC-MGB-3’

检测过程中PCR扩增反应体系如下表所示(20μL体系，单位μL)：

反应条件为：95℃预处理1min，进行45个循环反应，每个循环反应包括95℃1min，60.5℃℃45s，于53℃时测定荧光值；

根据上述体系扩增出的目标片段长度为624bp。

由于采用上述技术方案，本发明所具有的优点和积极效果是：设计的引物能覆盖GeneBank中已鉴定所有地杆菌属菌株，实验方法较为简洁实用，操作性强，实验效果良好，重复性好。

附图说明

说明书附图是本发明的地杆菌荧光定量PCR的标准曲线，显示地杆菌荧光定量PCR的标准曲线，标准曲线斜率为-2.966，y轴截距为36.06，R²＝0.989，效果较好。

具体实施方式

本发明涉及的引物和探针序列按以下步骤获得：要对厌氧生物反应器或天然厌氧环境中的地杆菌进行定量分析，必须找到合适的需要定量分析的基因。在对50多个基因进行考查后，拟用Pit-1基因。先从GeneBank中通过在线Blastn下载地杆菌Pit-1的所有序列及期望值小于10^-50的非地杆菌属的菌株的序列。对这些序列用Clustal X软件进行排序，用Ugene软件打开，可以较为方便地手动查找保守区域。

找到的第一个保守区域是CCGGACCTGCAACATCATCACC，第二个保守区域是CATCGACGACAAGGAGAAG，第三个保守区域是：GGCATCTCTTCCACCTCC(有的地杆菌属菌株的有1-3个不配对，这是允许的，不影响设计出来的引物与模板结合并进行扩增)。分别作为引物1、分子信标探针和引物2。

当然这是对采用TaqMan探针法进行实时定量PCR设计引物所需查找的保守区域，如果采用SYBR Green I作荧光染料，则只要找到两个保守区域就可以了。

接着按发明内容中的反应体系和参数进行扩增即可。