[发明专利]一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种以人3型腺病毒(HAdv3)为载体的新型肠道病毒71型-重组人3型腺病毒疫苗候选株及其制备方法。

背景技术

肠道病毒71型(EV71)是引起手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)的主要病原体之一，并常导致如无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹及神经源性肺水肿等严重的中枢神经系统并发症，并引起死亡。1969年首次报道全球爆发EV71感染，近年来，EV71爆发流行的报道增多，流行程度呈明显上升趋势，已经成为亚太地区包括国内威胁公众健康的重要病原体。EV71经空气飞沫等途径传播，具高致病性，相对死亡率较高，目前没有有效的治疗药物和方法，疫苗接种无疑是预防EV71病毒感染的最佳途径。

EV71属小RNA病毒科肠道病毒属，无包膜的单股正链RNA病毒，其衣壳由4种蛋白质组成：VP1、VP2、VP3和VP4。其中VP1、VP2、VP3在病毒粒子表面，而VP4在病毒粒子内部。有关EV71亚单位疫苗的研究已经显示，VP1由297个氨基酸组成，是衣壳蛋白中有着最大和最多的表面暴露的蛋白，包含了EV71病毒主要的中和性抗原表位，能刺激机体产生高滴度的保护性中和抗体，是制备EV71亚单位疫苗的最重要的蛋白。目前还没有临床应用的EV71疫苗。表位疫苗是用基于抗原表位制备的疫苗，是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。抗原表位是抗原分子中决定抗原特异性的序列，又称抗原决定簇，包括T细胞表位和B细胞表位，分别是T细胞抗原受体和B细胞抗原受体及抗体特异结合的基本单位。相较传统的疫苗，表位疫苗去除了不需要的甚至有害的抗原和表位而使免疫应答精确针对特定的表位。近年来已经有很多独特的表位已经被鉴定出来并应用于传染病、癌症和自身免疫性疾病的疫苗研究。然而单独的表位肽免疫原性弱，不能诱导免疫应答和免疫记忆，因而近年来发展了很多方法，如新型佐剂、脂肽偶联、应用通用T细胞表位、多抗原肽、纳米呈递系统及病毒载体等，促进了表位疫苗的发展。目前已经发现EV71病毒的多个中和性抗原表位，如VP1蛋白的163-177位氨基酸(PESRESLAWQTATNPC，SP55)和208-222位氨基酸(YPTFGEHKQEKDLEYC，SP70)。

腺病毒载体可以有效诱导体液和细胞免疫应答，已经广泛应用于癌症和感染性疾病的基因治疗和疫苗研究中。腺病毒分子量大，其本身是一种极好的免疫佐剂，能有效地刺激机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫；而且腺病毒载体具有容易进行基因操作、容易生产和高产量、高安全性的特点。传统的腺病毒载体疫苗是作为转基因载体，利用宿主细胞表达外源抗原，刺激机体产生抗原特异的体液或细胞免疫应答。由于人群中普遍存在针对人5型腺病毒载体的预存免疫，以及腺病毒载体的强免疫原性，导致免疫系统对载体的清除作用，抑制了转基因抗原的表达，使传统的腺病毒载体作为疫苗载体的应用受到很大的限制。近年来，采用“抗原展示”策略制备的重组腺病毒疫苗得到发展，即在不影响病毒的感染性及稳定性的前提下，在腺病毒载体衣壳中嵌入外源性抗原从而获得具有新的抗原特性的重组腺病毒粒子。目的抗原肽插入衣壳后作为病毒壳体的一部分，将能多次免疫机体诱导有效的免疫应答，而不需要进行转基因表达，克服了传统的腺病毒转基因载体受机体抗载体免疫限制的缺点。

腺病毒颗粒是一个二十面体的对称结构，壳体由12个位于顶角的五邻体基座和纤维蛋白，240个非顶角颗粒的六邻体(hexon)以及结构辅助蛋白多肽构成。六邻体是三聚体结构，是腺病毒颗粒中最丰富的免疫原，在六邻体蛋白中插入一个外源抗原表位，则每个腺病毒粒子就可以展示720个抗原表位，抗原表位可得以充分表达。不同型别腺病毒的六邻体蛋白的氨基酸序列有高达78-95％的同源性，其区别主要集中在7个高变区(HVRs)，这些高变区暴露于病毒壳体表面，不涉及六邻体单体间的相互作用，也不与其它的腺病毒蛋白相互作用。已有多个基于5型腺病毒的研究表明六邻体的多个高变区具有足够的柔韧性，可以嵌入不同长度的外源肽而不影响病毒的复制、稳定性和功能；而且表位嵌合入某些特定的HVR区的腺病毒载体有可能能够在体内和体外逃避预存的腺病毒免疫，提供更强的免疫原性。

因此，衣壳展示EV71中和表位，同时转基因表达EV71的主要抗原VP1蛋白，并保留人3型腺病毒主要抗原的肠道病毒71型-重组人3型腺病毒疫苗候选株有望用于同时预防EV71感染和HAdv3感染。

发明内容

本发明提供一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用。