[发明专利]铁皮石斛内生细菌特异性巢氏PCR检测方法及所用引物

权利要求书

1.巢式PCR扩增引物，其特征是：包括第一次PCR扩增引物和第二次PCR扩增引物，

所述第一次PCR扩增引物为：

fM1：5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’，

rC5： 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’；

所述第二次PCR扩增引物为：

GC夹-f515：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGT GCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；

rC5： 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。

2.利用权利要求1所述巢式PCR扩增引物进行的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR快速检测方法，其特征是包括如下步骤：

1）、铁皮石斛总基因组DNA的提取；

2）、特异性巢氏PCR扩增16S rRNA基因的特定片段：

第一次PCR扩增时，退火温度为50-54℃；

第二次PCR扩增时，退火温度为55-59℃；

3）、DGGE分析；

将巢氏PCR的第二次扩增产物进行DGGE电泳； 

4）、内生细菌的种属鉴定：

选择清晰的DGGE条带，进行PCR扩增；将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对，确定其种属特征。

3.根据权利要求2所述的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法，其特征在于：

所述步骤3）为：

DGGE电泳采用6%丙烯酰胺凝胶、30%-60%的变性剂浓度梯度；打开电泳仪使电泳缓冲液预热60-120min至温度为55-65℃；加40-60μ1 PCR产物，120-180V电泳5-10h后，将DGGE胶在EB溶液中染色10-20 min，脱色15-30min，用凝胶成像系统拍照。

4.根据权利要求3所述的铁皮石斛内生细菌的特异性巢氏PCR检测方法，其特征在于：

所述步骤4）为：

选择清晰的DGGE条带，割胶回收于1.5ml Eppendorf管中，用无菌研磨棒研磨，加入50 μ1无菌水，37℃温浴15-30 min，置4℃冰箱12-16h；1500~2500 rpm离心4~6min，吸取3-5 μ1上清作为模板，用引物f515和rC5进行PCR扩增，退火温度为54-58℃；将扩增片段进行克隆、测序和BLAST比对，确定其种属特征；

引物f515：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，

引物rC5：5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。