[发明专利]突变改造的有机磷农药降解酶及其编码基因

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及通过基因工程改造（随机突变改造）的有机磷农药降解酶。

背景技术

农药残留严重危害生态环境，危害人民群众的身体健康，是各国都需要面对的严峻问题。研究发现，不同地区的地下水、农作物及土壤都的遭受到了农药残留的污染。我国是农业大国，每年的农药使用量巨大，随之而来的农药残留问题也日趋严重。相关数据显示我国农产品的农药残留超标严重，居民日常膳食中的各类农药摄入量高于发达国家数十倍。近年来，农药残留的去除技术成为研究焦点，寻找一种安全、高效的去除农药残留的方法具有重要意义。

农药降解酶是去除农药残留的有效技术手段，具有降解迅速、使用安全、环境友好等特点。目前已经发现了多种农药降解酶，例如有机磷农药降解酶OPH、有机磷农药降解酶MPH、菊酯类农药降解酶B1等。其中，国内外对于有机磷农药降解酶研究的最为深入。有机磷农药降解酶OPH最先在Flavobacterium sp.ATCC27551（Mulbry and Karns,1989）和Pseudomonas diminuta MG（McDaniel et al.,1988）中分离得到，有机磷农药降解酶MPH首先由我国学者在Plesiomonas sp.strain M6中发现（崔中利等,2001）。有机磷农药降解酶OPH和MPH都具有广泛的降解谱，可以降解甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、敌敌畏等农药，是农药降解酶领域的关键酶。有机磷农药降解酶OPH的基因改造工作进行的比较深入，研究人员通过DNA shuffling技术成功将有机磷农药降解酶OPH对甲基对硫磷的降解活性提高了25倍（Catherine Mee-Hie Cho et al.,2002），对毒死蜱的降解活性提高了700多倍（Catherine Mee-Hie Cho et al.,2004），这些成功的基因改造使OPH拥有了更优秀的酶学性质，有利于其在农药残留降解领域的应用，具有重要的实际应用价值。

相对于有机磷农药降解酶OPH，有机磷农药降解酶MPH的基因改造并没有获得如此显著的成果。研究人员通过定点突变，使有机磷农药降解酶MPH获得了更优秀的热稳定性和酸碱稳定性（Jian Tian et al.,2010;Yidan Su et al.,2011；Lu Huang et al.,2012）；通过随机突变手段，获得了一株突变位点为K173R的突变株，其对毒死蜱的降解效率比野生型酶提高了41.55%（李亚楠等，2012）。有机磷农药降解酶MPH在基因改造方面的研究还有待于深入研究和开发，通过基因工程手段改造有机磷农药降解酶MPH，获得酶活力和热稳定性提高的突变体酶对于解决农药残留问题具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于利用基因工程手段改造有机磷农药降解酶MPH，使其获得更加优秀的酶活力和热稳定性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

有机磷农药降解酶MPH的N端35个氨基酸为信号肽序列，本发明随机突变的对象为不含信号肽编码序列的成熟mpd基因。

采用易错PCR的方法对Pseudomonas stutzeri strain ZK-5来源的有机磷农药降解酶MPH编码基因（mpd，GenBank登录号：JQ686087）进行随机突变。

易错PCR反应体系（50μL）为：mpd基因（GenBank登录号：JQ686087）50ng作为模板，上游引物和下游引物各0.3μM，dNTPs各200μM，10μL突变缓冲液，5U Taq DNA聚合酶，5μLPCR缓冲液。易错PCR反应条件为：94℃热变性5min,94℃热变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,30个循环。

上游引物：5’-GAATTCTGCAGCACCGCAGGTGCGCACC-3’下游引物：5’-TCCGGAAGCTTTCATCATCACTTGGGGTTGACGACCG-3’突变缓冲液组成为：dTTP4mM,dCTP4mM,MgCl₂ 27.5mM,MnCl₂2.5mM，溶剂为去离子水。

PCR缓冲液组成为：100mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl and 15mM MgCl₂，溶剂为去离子水。