[发明专利]短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

背景技术

近年来, 恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，肿瘤已成为死亡常见原因之一，严重影响着人类的健康。人结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，现在已经发现部分癌基因（如set、survivin、c-myc、Bcl-2等）和抑癌基因（如p53、DCC、nm23、APC、PTEN 、PP2A等）与人结直肠癌的发生、发展有密切关系，但是至今还有许多与人结直肠癌发病相关的致癌基因、抑癌基因尚未发现。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的技术。该技术已被用于疾病基因治疗领域，例如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。在抗病毒治疗方面，帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法，肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。该技术比其它治疗手段的毒副作用会更低，因此开发更多的针对癌症的RNA干扰片段具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的短发夹shRNA，并证明所述shRNA片段可在制备治疗结直肠癌的药物中应用。

人c2orf68基因已在GenBank注册，注册号NM-001013649.3，定位于2p11.2，全长4283bp，编码166个氨基酸，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。人c2orf68基因的组织表达谱分析显示：该基因在结直肠癌等胃肠肿瘤中均有表达。

本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点来源于序列表中SEQ ID NO：1所述的人c2orf68基因，是SEQ ID NO：1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO：3。

本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA由人工设计合成，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述。

实验表明，将所述shRNA转染入人直肠癌细胞，shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖，因此，本发明所述短发夹shRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明为制备治疗人结直肠癌的药物提供了一种新方法，可促进人结直肠癌新药的开发。

2、本发明所述shRNA片段不仅可应用于制备治疗人结直肠癌的药物，而且可用于人c2orf68基因在结直肠癌发病中的作用和机理研究。

附图说明

图1 是荧光定量PCR实验中人c2orf68基因引物的标准曲线图。

图2 是荧光定量PCR实验中内参gapah基因引物的标准曲线图。

图3 是人结直肠癌细胞株SW480的siRNA组（转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480）、阴性对照组SW480^-NC、空白对照组（未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480）中人c2orf68基因表达的柱状图。

图4 是人结直肠癌细胞株SW620的siRNA组（转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620）、阴性对照组SW620^-NC、空白对照组（未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620）中人c2orf68基因表达的柱状图。

图5是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480-siRNA、阴性对照细胞株SW480-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480的细胞凋亡图。

图6是流式细胞仪检测SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的细胞凋亡率柱状图。

图7是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620-siRNA、阴性对照细胞株SW620-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620的细胞凋亡图。 

图8是流式细胞仪检测SW620-siRNA、SW620-NC、SW620细胞株的细胞凋亡率柱状图。

图9是MTT实验中SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的生长曲线图。