[发明专利]十字花科蔬菜根肿病菌荧光定量PCR检测技术及应用

权利要求书

1.一种十字花科蔬菜根肿病菌的荧光定量PCR检测技术，其特征在于包括以下步骤：

取田间自然发病土壤、发病植株、十字花科蔬菜种子，进行总DNA的提取纯化，得到DNA样本；

特异性引物设计，在系统分析根肿病菌的ITS区、18SrRNA和5.8rRNA核酸序列系统发育的基础上，采用CLUSTAL，与根肿菌纲及土传病原菌的该区序列进行比较，寻找根肿病菌的特异性序列区域，设计特异性引物对1（PBF2/PBR2），引物对2（PBF3/PBR3），所述的引物对为：

引物对1 正向引物5^，-CTTGCGTGTCGCTGTATTC-3^，

^{反向引物5，-ATAGGTTGGGGTAACTTGGC-3，；}

引物对2 正向引物5^，-CTCACAACGATGAAGAAC-3^，

反向引物5^，-ACTCACAGCCAAAGACAAGC-3^，

3） 实时荧光定量PCR反应体系为：荧光定量PCR反应体系总体积为25μl，其中SYBR Premix Ex Taq(内含TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg²⁺和 SYBR GreenⅠ) 12.5μl，浓度为10μmol/L的正义引物PBF2（PBF3）和反义引物PBR2（PBR3）各0.5μl，标准品10倍梯度稀释液或待检测样品DNA溶液2μl，ddH₂O补齐至25μl；

4）PCR反应程序为：PCR采用两步法，95℃3min，接着进行40个循环，每个循环包括95℃10s、60 ℃30s；PCR完成后，按0.1℃ s^-1升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；

5）插入ITS区的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒基因组DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释，稀释成6个浓度梯度，按照上述PCR反应体系和程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；

6）取步骤1）中得到的DNA样本作为模板，按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用ddH₂O，阳性对照采用根肿菌菌株基因组DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值（Ct）与标准曲线对照，得到DNA样本中的ITS区基因片段拷贝数，进而得到原来样本中根肿病菌的浓度。

2.权利要求书1所述的检测十字花科蔬菜根肿病的荧光定量PCR检测技术可以转化成商品化的试剂盒，试剂盒包括：正义引物PBF2、反义引物PBR2（正义引物PBF3、反义引物PBR3）、荧光染料SYBR Premix Ex Taq 内含TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg²⁺和 SYBR GreenⅠ、以及由插入ITS区的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5α增殖后提取的质粒DNA，DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释。

3.该技术可以应用于对农田环境中，包括对土壤中越冬菌量和十字花科蔬菜植株上根肿病菌进行实时监测，以及检测十字花科蔬菜种子带菌和田间灌溉水中的根肿病菌。