[发明专利]适体在蛋白质组学中的用途

说明书

本发明是申请日为2008年10月10日，申请号为200880120684.1（国际申请号为PCT/GB2008/003447），名称为“适体在蛋白质组学中的用途”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及复杂混合物中蛋白质的鉴定和定量。具体而言，本发明涉及适体(aptamer)作为复杂混合物中蛋白质和蛋白质数量的标签(tag)或代替物(proxy)的用途。在另一个方面，本发明涉及下一代多核苷酸测序方法在蛋白质组学中的用途。

背景技术

蛋白质组通常被描述为在生物学系统(例如细胞、组织、体液、器官或生物体)中找到的蛋白质的全集。对天然存在蛋白质的研究通常称作“蛋白质组学”且涵盖对在特定时间时和/或在感兴趣的内部或外部条件下表达的蛋白质组的研究。蛋白质组学方法常常针对蛋白质组的整体分析且要求能自一份或多份样品解析、鉴定和定量多种(例如数百种或数千种)蛋白质。

蛋白质组学的承诺中有其识别新的生物标志物(即作为生物学指示剂发出生理学状态改变(例如由于疾病或治疗性干预)的信号的蛋白质)的能力。生物标志物发现通常涉及比较在不同生理学状态中表达的蛋白质组并鉴定其存在或表达水平在生理学状态间一致不同(consistently differ)的蛋白质(Schrattenholz A,Groebe K.Electrophoresis.(2007)Jun 28(12)1970-9)。

血液中的蛋白质是鉴定疾病状态和药物治疗标志物的特殊靶物。广泛假设，血液中的蛋白质的量和/或构象应当在统计上与此类状况有关，其方式在权重上超过内在的天然变异性。血液和其它体液是特殊的靶物，因为它们浸泡(bathe)受影响组织，转运生死攸关的蛋白质且能在医学会诊过程中使用相对便宜和直接的规程获得供测试用。

然而，血液中的蛋白质具有很大范围的浓度，其中少数蛋白质占比超过所有蛋白质的99.9%而且其它蛋白质占据的分布为皮克至毫克每毫升(Qian W.J.等,Mol.Cell.Prot.(2006)5(10)1727-1744)。由于现有蛋白质组学技术的限制，此丰度范围仍然是假设的。蛋白质组学科学家采用多种方法来达到此范围，目的也是使对蛋白质相对丰度的破坏最小化。这常常要求通过选择性纯化来排除高丰度的蛋白质。还尝试通过选择性聚焦样品中所有肽的子集来降低所获得的肽的复杂性。这些规程是漫长的，而且样品、复制品、仪器和实验室间的再现性仍有待以生物标志物蛋白质的统计发现(statistical discovery)的必要方式来证明。

生物标志物发现中常常使用的基于常规质谱术(MS)的蛋白质组学通过将生物学样品分开以自所研究的混合物分离单一蛋白质来进行。最近，这从二维凝胶前进至多维基于柱的高效液相层析(HPLC)。蛋白质能被分解成较短的亚基或肽。然后将分离的肽进料入质谱仪中，质谱仪将肽离子化并使它们进一步分解，产生质量/电荷测量的梯状物。这些测量及其丰度也能在多种方案下量化，通常是相对于一些对照。然后将所得图谱梯状物针对已知肽序列或盲目地自原始数据进行解读，并使用获得的质量和序列信息来搜索序列数据库以鉴定作为各肽起源的蛋白质。

然而，复杂生物学样品的蛋白质水解通常产生数以十万计的肽，它们会压倒已知层析和MS系统的分辨能力，引起不完全的分辨和组分肽鉴定受损。通常，在基于MS的蛋白质组学中，自样品得到的图谱中多达80%不能正确或一致地重解读成差别肽或(因此)蛋白质。它们在MS过程中的片段化行为和丰度也能是依赖背景的，进一步使再现性变复杂(Liu H,Sadygov RG， Yates JR3rd.,Anal.Chem.(2004)Jul 15 76(14)4193-201)。

使生物学样品的蛋白质组分析能够进行的一种方法是在对所生成的肽混合物进行下游解析和鉴定步骤(如层析分离和/或质谱术(MS))之前，降低由分开此类样品来产生的所述肽混合物的复杂性。理想的是，降低蛋白质肽混合物的复杂性会降低样品的每种个别蛋白质所存在的不同肽的平均数目，仍会使肽混合物中实际呈现的样品中蛋白质的级分最大化。

蛋白质的生物学加工以使基于MS的确认混淆的多种方式使血液(血清或血浆)的使用进一步不明(Qian W.J.等,Mol.Cell.Prot.(2006)5(10)1727-1744)。最近的研究显示了极其矛盾的自临床样品鉴定和计数蛋白质的尝试。就是以常规的基于MS的蛋白质组学分离、断裂和测量蛋白质的动作改变了它们的相对丰度和化学组成。