[发明专利]重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。

背景技术

核因子相关因子2 (NF-E2-related factor 2，Nrf2)是调控肠粘膜谷胱甘肽-S-反转移酶（glutathione S-trans ferase，GST）基因表达的关键信号分子。抗氧化反应元件（Antioxidant Response Element，ARE）是GST基因启动子区域的5′-TGACnnnGC-3′序列。研究表明：信号分子Nrf2与GST基因的ARE序列结合，可激活GST转录。鼠和人的Cu/ZnSOD基因启动子上游区域存在ARE序列。然而，不同物种之间Cu/ZnSOD的基因全序列特征存在很大差异。人的Cu/ZnSOD基因组序列为8419bp（有5个外显子和4个内含子），但海湾扇贝基因全序列仅为4279bp（只有4个外显子和3个内含子），而果蝇基因全序列比较短，只有1425bp（仅有2个外显子和1个内含子）。因此，鱼的Cu/ZnSOD基因表达的调控与其它动物可能存在差异，需要进一步研究。有限的研究表明：Nrf2是大鼠心脏Cu/ZnSOD基因转录的信号分子。但是，Nrf2是否是水生动物肠细胞Cu/ZnSOD基因转录的信号调控分子未见研究报道，开展研究非常必要。

迄今，关于Nrf2在哺乳动物细胞抗氧化蛋白质合成中发挥的调节作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳动物细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见有关低等脊椎动物鱼类细胞中Nrf2的研究报道，也未见有鲤鱼Nrf2基因的cDNA全长核苷酸序列和与其对应的氨基酸序列的报道。

研究和开发与鲤鱼Nrf2蛋白相关的基因克隆及其重组表达具有极其重要的作用，因为研究清楚鲤鱼的Nrf2基因和蛋白的功能，可以用于研究营养物质提高细胞抗氧化能力的机制等方面，由重组Nrf2基因序列设计的荧光定量引物和表达蛋白制备的抗体可以检测Nrf2基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况，对进一步阐明Nrf2调控这些基本生物过程的机理意义重大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组鲤鱼Nrf2基因、蛋白及其制备与检测方法和应用。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：一种重组鲤鱼NRF2基因，为下述序列之一：1)序列表中SEQ ID No：1所示的基因序列；2) 将SEQ ID NO :1所示的基因序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且与SEQ ID No：1所示的基因序列表达的氨基酸序列相同的基因序列。

一种重组鲤鱼NRF2氨基酸序列，为下述序列之一：1) SEQ ID NO :2所示的由权利要求1所述重组鲤鱼NRF2基因所表达的氨基酸序列；2)将SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与具有与SEQ ID NO :2的氨基酸序列相同活性的由SEQ ID NO :2序列衍生的蛋白质。

一种上述重组鲤鱼NRF2基因的制备方法，包括下述步骤：

1）采集鲤鱼的总RNA并以其肠道组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链；

2）以步骤1）中的cDNA第一链为模板，利用引物N1、N2进行PCR扩增，得到SEQ ID NO :1所示的序列，所述引物N1具有SEQ ID NO :3所示的序列，引物N2具有SEQ ID NO :4所示的序列；

所述步骤2）中以Nl、N2为引物，利用DNA聚合酶进行PCR反应的50μl PCR扩增体系中各组分及其比例为：cDNA第一链，2.5 μl；50μM 的N1，0.25μl；50μM的N2，0.25μl；10×LA PCR Buffer II，5.0μl；each 2.5 mM 的dNTP Mixture，8.0μl；ddH₂O，33.5μl；5 U/μl的DNA聚合酶，0.5μl；反应循环条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec，60℃退火30 sec，72℃延伸2 min，共40个循环；最后72℃延伸 10 min，反应完成。

一种上述方法制备的重组鲤鱼NRF2基因的检测方法，包括下述步骤：