[发明专利]一种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，包括：

(1)取新鲜小麦胚芽进行低温脱脂、粉碎处理，而后以水作为溶剂进行提取操作；

(2)去除步骤(1)所获混合提取液中的不溶物，并以硫酸铵对所获上清液进行分级沉淀，其后分离出沉淀物，再将沉淀物复溶于水中进行透析处理，之后依次进行浓缩、冷冻干燥处理，获得小麦胚芽水溶性蛋白；

(3)将所述小麦胚芽水溶性蛋白溶于缓冲液中，并依次进行离子交换层析和凝胶过滤层析处理，获得目标产物。

2.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(1)包括：以低温萃取方式对小麦胚芽进行脱脂处理至小麦胚芽粕中的残油值在2.0wt％以下；

所述低温萃取包括超临界二氧化碳萃取、四号溶剂加压萃取或有机溶剂低温萃取。

3.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(1)包括：将脱脂后的小麦胚芽粕粉碎后过80-100目筛获得脱脂麦胚粉，其后按照10∶1(v/w)的液料比将水与脱脂麦胚粉混合，并搅拌提取，形成混合提取液。

4.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(2)包括：对步骤(1)所获混合提取液进行离心处理，分离出其中的不溶物，同时收集上清液，并分步缓慢加入硫酸铵至上清液中停止析出沉淀物，而后离心分离出所述沉淀物，再将沉淀物复溶于水中，之后依次进行透析、浓缩和冷冻干燥处理。

5.根据权利要求4所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(2)还包括：将所述不溶物再次以水进行提取操作，其后再次离心分离出不溶物，并再次收集上清液，之后加入硫酸铵进行分步分级沉淀。

6.根据权利要求4或5所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(2)中的离心操作均采用低温离心操作，所述低温离心操作的条件包括：转速为8000r/min以上，温度在0～4℃，时间为20min以上。

7.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(3)包括：将所述小麦胚芽水溶性蛋白溶于Tris-HCl缓冲液中，并依次过DEAE-Sepharose FF离子交换层析柱和Superdex20010/300GL凝胶过滤层析柱，获得目标产物。

8.根据权利要求7所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(3)中所述离子交换层析处理及凝胶过滤层析处理的条件包括：以缓冲液作为洗脱液，并且所述洗脱液的流速分别为1.0～2.0mL/min、0.2～0.5mL/min。

9.根据权利要求1所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，具体包括：

(1)取除杂后的新鲜小麦胚芽进行低温脱脂，再将脱脂后的小麦胚芽粕风干后过60～80目筛，除去附着的细粉，而后粉碎过80～100目筛，获得脱脂麦胚粉；

(2)按8∶1～12∶1(v/w)的液料比将水与脱脂麦胚粉混合，以180～220r/min的速度振荡提取3h以上，其后低温离心，收集上清液，并将分离出的固形物与水按照4∶1～6∶1的液料比提取1h以上，之后再次低温离心，合并上清液，并分步缓慢加入硫酸铵至达到饱和状态，而后静置3h以上，低温离心出沉淀，加水复溶后装入透析袋中，置于4℃以下的水中透析24h以上，浓缩后冷冻干燥，制得小麦胚芽水溶性蛋白；

(3)将小麦胚芽水溶性蛋白溶解于pH值7.4～8.0、10～20mmol/LTris-HCl缓冲液中，且使形成的小麦胚芽水溶性蛋白溶液的浓度为5～10mg/mL，再上样于经过上样缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，并以含0～0.8mol/LNaCl的pH值7.4～8.0、10～20mmol/LTris-HCl缓冲液为洗脱剂按照1.0～2.0mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱物置于4℃以下的水中透析24h以上，冷冻干燥，分离得到抗肿瘤活性组分；

(4)将抗肿瘤活性组分溶解于pH值7.4、含有50～150mmol/LNaCl，30～60mmol/L磷酸盐缓冲液，且使形成的抗肿瘤活性组分溶液的浓度为以2～4mg/mL上样于经过平衡的superdex20010/300GL凝胶柱，用缓冲液按照0.4mL/min的流速洗脱，获得目标产物。

10.根据权利要求9所述的小麦胚芽抗肿瘤蛋白的制备工艺，其特征在于，步骤(2)中0℃下硫酸铵的饱和度为20wt％～40wt％。