[发明专利]一种检测含有KPC-15基因肺炎克雷伯菌的PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及肺炎克雷伯临床耐药菌株，具体涉及一株肺炎克雷伯临床耐药菌株携带有新耐药的基因KPC-15。本发明还涉及检测携带有KPC-15基因的PCR检测方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌是医院感染的常见病原菌，其耐药的主要机制是细菌产生质粒介导的超广谱-内酰胺酶(ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)。碳青酶烯类抗菌药物是目前临床使用的抗菌谱广、抗菌活性强的一类抗菌药物，尤其对产ESBLs和AmpC酶肠杆菌科细菌感染的治疗有较好的疗效；但随着碳青酶烯类抗菌药物在临床上使用增加，碳青霉烯类抗生素的耐药性也不断增加且多重耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。近年来，碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌呈世界性流行。

肠杆菌科细菌对碳青霉稀类抗生素耐药的机制主要为AmpC酶过度表达合并外膜孔蛋白丢失，青霉素结合蛋白对碳青霉烯类抗生素亲和力的下降，碳青霉烯类抗生素水解β-内酰胺酶的产生1。其中，耐药的主要机制就是细菌产生碳青霉烯酶。

KPC(Klebsiellapneumoniae carbapenemase，KPC)型碳青霉烯酶属于功能分类法的2f组，分子分类法的A类，是一种由质粒介导的丝氨酸β-内酰胺酶，以丝氨酸作为活性位点，是目前引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯类耐药的主要原因。自2001年首次报道第一株产KPC酶肺炎克雷伯菌后，迅速在世界各地出现传播[5]。由于KPC酶对抗生素广泛的水解活性和编码基因的可移动性，它的出现和流行给临床治疗带来严重威胁，已成为全球性的公共卫生问题，也是各国医务人员关注的焦点。

2007年，浙江省报道了全国第一例产KPC酶肺炎克雷伯菌16，随后产KPC酶细菌在浙江省及华东地区等省市快速蔓延，可能与东部地区经济发达、医疗水平较高及抗生素的使用有关，给碳青霉烯酶类抗生素的使用及肠杆菌科细菌感染治疗造成严重威胁。近来，产KPC酶菌株在全国也有逐渐增多的趋势并在多个地方造成流行。KPC型碳青霉烯酶是一种由质粒介导的丝氨酸β-内酰胺酶，这一基因定位在质粒上的特性可能是其易于传播和播散的原因。

现在世界范围有KPC-2至KPC-15(登入号KC433553)14种KPC基因变异亚种，KPC-1因为发现检测有误，实际上与KPC-2是同一亚型，已取消命名。

本研究者从台州市立医院心胸外科病人的血液培养标本中分离得到一株肺炎克雷伯临床耐药菌，编号为KP1241该菌株表现出对亚胺培南、厄他培南的耐药，经法国生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定为肺炎克雷伯细菌。通过对该菌株所携带质粒的分析，发现了一个新的KPC基因亚种(KPC-15)，进一步的通过质粒转导实验，发现该基因导致细菌对多种药物耐药。

新耐药基因的发现，对于合理使用抗生素、减少严重感染时产生碳青霉烯类耐药细菌，以及研发新药物抑制细菌耐药性意义重大。基于上述目的，研制快速检测样品中KPC-15基因的PCR检测试剂盒以实现对含KPC-15基因致病菌的快速、准确地检测，有利于进一步监测耐药菌株、指导临床合理用药、减少耐药菌产生和传播，同时研究抗生素的耐药机制及基因环境开辟了新的道路。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种KPC-15基因的PCR检测试剂盒，用于含有KPC-15的肺炎克雷伯临床多重耐药菌的检测。

本发明从台州市立医院心胸外科病人的血液培养标本中分离得到一株肺炎克雷伯临床耐药菌，编号为KP1241该菌株表现出对亚胺培南、厄他培南的耐药，经法国生物梅里埃公司的VITEK2Compact全自动细菌鉴定药敏分析仪鉴定为肺炎克雷伯细菌。通过对该菌株所携带质粒的分析，发现了一个新的KPC基因亚种，命名为KPC-15。

利用设计的扩增引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4扩增KPC-15基因，并用设计的测序引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6对PCR产物进行测序，将测序结果在NCBI上进行BLSAT比对，发现KP1241所携带的KPC基因为新的KPC变异基因，对蛋白序列进行分析发现，该变异主要变异在第119突变成L，第146为突变成K。KPC-15基因ORF和氨基酸序列分别见序列：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。