[发明专利]珍珠母蛋白N16的制备方法及其在制备防治骨科疾病药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及珍珠母蛋白N16的制备方法及其用于防治骨质疏松症、骨折等骨科疾病的用途。

背景技术

骨质疏松症是指以骨量低及组织微结构退行病变为特征、骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病。该病在中老年人群中尤为常见。据国际骨质疏松基金会的统计数据显示，骨质疏松症目前危害着全球大约三分之一50岁以上的女性和五分之一50岁以上的男性。目前全世界约2亿人患有骨质疏松症，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。我国是世界上人口最多的国家，骨质疏松症发病率在65岁以上的人群中高达90%。随着世界人口的增加和平均寿命的提高，骨质疏松症的威胁将越来越大，为社会医疗体系带来沉重的负担。如何防治骨质疏松症已成为是世界性的难题。

导致骨质疏松的原因是多方面的，包括个体年龄、性别、身体状况等。人体骨骼一直在进行重建，破骨细胞吞噬旧骨，成骨细胞产生新的骨质，替补被吞噬的旧骨，从而维持骨量以及骨的质量。从根本上而言，骨质疏松症的发生是由于骨重建失衡，破骨细胞进行的骨吸收造成的流失的骨量大于成骨细胞进行的骨形成产生的骨量。

目前，治疗骨质疏松症的药物，主要分为骨吸收抑制剂和骨形成促进剂两大类。常用的骨吸收抑制剂有二磷酸盐、雷洛昔芬等。单纯的骨吸收抑制剂具有抑制破骨细胞的成熟与功能的活性，但只能减缓骨量流失，不能从根本上治疗骨质疏松症。而目前市面上常见的治疗骨质疏松症药物是骨吸收抑制剂。虽然骨形成促进剂能增加骨量，相对于骨吸收抑制剂有明显优势，但目前市场上骨形成促进剂只有Teriparatide、Preotact等少类药物，价格昂贵，且长期使用有可能刺激骨吸收，并增加患者产生骨肉瘤的风险，安全性低。可双向调节骨重建平衡能力的抗骨质疏松症药物同时具备促进骨形成和抑制骨吸收的作用，具有明显的优势，但只有雷尼酸锶一种药物可供患者选择。另一方面，在国内，由于生产商、销售商在宣传上的误导，目前充斥市场的含钙制品铺天盖地，均以“补钙”为目的，这与骨质疏松的治疗机理相差甚远。因此，寻找具有双向调节骨重建平衡的新型抗骨质疏松症药物是当前研究的热点。 

 研究报道，珍珠母的水溶性蛋白具有促进成骨活性，能促进骨损伤修复，显着提高去卵巢大鼠的骨密度，提高新生鼠颅骨的原代培养细胞和MRC-5（人类胎儿成纤维细胞系）细胞的碱性磷酸酶活性，刺激成骨细胞的分化和产生矿化结节，促进骨形成。例如：Ｍ．Ｌamghari等人研究证明从珍珠母得到的水溶性成分在高浓度时能够诱导Wister属大鼠的大腿骨基质干细胞的生长（M.Lamghari，M.J.Almeida，S.Berland，etc.Stimulation of Bone Marrow Cells and Bone Formation by Nacre：In Vivo and In Vitro Studies，Bone，1999,25（2）：91S-94S.)。中国200510101001.6号专利申请公开了一种水溶性珍珠母蛋白提取物，在一定条件下可促进MSCS细胞分化为成骨细胞的作用，并且能促使其形成矿化结节的作用。

珍珠母蛋白具有良好的生物相容性，安全性高。在国内外，珍珠母粉被认为是一种良好的骨组织替代材料。珍珠母移植或透皮注射到动物体内无免疫排斥反应或明显毒副作用。

珍珠母蛋白N16属于非水溶性珍珠母蛋白，分子量为16 kDa，在1999年由Samata等人在珍珠母不溶于水的组分中发现（Samata T, Hayashi N, Kono M, Hasegawa K, Horita C, Akera S. A new matrix protein family related to the nacreous layer formation of Pinctada fucata. FEBS Lett. 1999 Nov 26; 462(1-2):225-9.。并认为N16能影响碳酸钙结晶的形状。但目前还没有关于珍珠母非水溶性蛋白N16在治疗骨科疾病药物中应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种珍珠母蛋白N16的制备方法，并公开其在制备防治骨质疏松症及骨折药物中的应用。

为实现上述目标，本发明通过下述技术方案实现：

珍珠母蛋白N16（下简称为“N16”）的制备，由下述步骤完成：

1、从马氏珠母贝Pinctada fucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA；

2、根据NCBI数据库N16的基因序列，设计引物：