[发明专利]具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法。

背景技术

随着现代生活水平的提高，人们越来越关注紫外辐射的问题。越来越多的抗紫外辐射化妆品也随之诞生。目前市场上抗紫外辐射的产品其主要成分为多糖类、多酚类、黄酮类、胶原蛋白和植物蛋白（如藻蓝蛋白）等。

抗紫外辐射的试验可采用动物模型，如文镜在《营养学报》2001, 23 (1):44-47报道的给小白鼠连续灌胃金属硫蛋白（MT）30 天后分别接受7 Gy、8 Gy ⁶⁰Co-γ一次性辐照或每周一次1 Gy小剂量连续8次辐照，通过采血测定白细胞和淋巴细胞等指标以判断金属硫蛋白是否具有抗紫外辐射的作用，发现口服MT具有一定的抗紫外辐射功能。这种直接通过动物实验的方法，准确性高，但测试过程繁琐。抗紫外辐射的另一种试验方法是采用活体细胞模型。例如，Takeshi Saito在Japanese Journal of Ophthalmology, 54(5):486-493中报道的通过建立Lens Epithelial 细胞模型来研究金属硫蛋白的抗紫外辐射作用。与此类似的方法如黄敏钧在《广东茶业》,2010,4:30-33中报道的通过NIH/3T3细胞模型研究了普洱茶的抗紫外辐射作用。研究表明，用细胞模型进行抗紫外辐射试验具有简便、准确和快速等优点。

迄今已发现许多藻类多糖具有抗紫外辐射的功能，但是对藻类蛋白的抗紫外辐射研究还较少涉及，特别是藻类类金属硫蛋白的抗紫外辐射功能还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法。

为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：

本发明是一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法，它包括以下步骤：

（1）活体细胞经0.25%胰酶消化3-8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞；

（2）在24孔板中各加入0.3 mL细胞悬浮液，于37℃及5% CO₂气氛的培养箱中培养24 h；

（3）取出24孔板，此时细胞完全贴壁，弃上清液，加入以pH 7.4的PBS为介质的小球藻类金属硫蛋白制品0.3 mL，在距离紫外灯管25 cm处辐射0-9 J/cm²；

（4）弃上清液，加入37℃预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中培养12 h；

（5）弃上清液，往各孔加入2 mg/mL的MTT溶液0.1 mL，继续培养2 h后，加入0.5 mL DMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值；

（6）以pH 7.4的PBS溶液 0.3 mL替代小球藻类金属硫蛋白制品进行对照试验，通过比较试验组和对照组的吸光度值说明小球藻类金属硫蛋白的抗紫外辐射能力。

所述的小球藻类金属硫蛋白的试验浓度范围为1.25~10 mg/mL。

所述的活体细胞为NIH/3T3细胞，它包括以下步骤：

（1）NIH/3T3细胞经0.25%胰酶消化3 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞；

（2）在24孔板中各加入0.3 mL细胞悬浮液，于37℃及5% CO₂气氛的培养箱中培养24 h；

（3）取出24孔板，此时细胞完全贴壁，弃上清液，加入以pH 7.4的PBS为介质的小球藻类金属硫蛋白制品0.3 mL，在距离紫外灯管25 cm处辐射6 J/cm²；

（4）弃上清液，加入37℃预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中培养12 h；

（5）弃上清液，往各孔加入2 mg/mL的MTT溶液0.1 mL，继续培养2 h后，加入0.5 mL DMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值；

（6）以pH 7.4的PBS溶液 0.3 mL替代小球藻类金属硫蛋白制品进行对照试验。通过比较试验组和对照组的吸光度值说明小球藻类金属硫蛋白的抗紫外辐射能力。

所述的活体细胞为HaCaT细胞，它包括以下步骤：

（1）HaCaT细胞经0.25%胰酶消化8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞；