[发明专利]一种替代检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法

权利要求书

1.一种替代检测猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的新方法，其特征在于：将猪瘟兔化弱毒株2倍梯度稀释，然后接种于PK-15细胞，在37℃含5%的CO₂培养箱中培养5日进行免疫荧光法的测定，Reed-Muench法计算病毒价，即为TCID₅₀；

其中病毒的稀释：

将空白的96孔板中加入100μl的无血清的MEM，然后将已知兔热反应的猪瘟兔化弱毒株用移液器吸取100μl加入96孔板的第1排，每个稀释度做8重复，用移液器反复吹打混匀，从第1排吸取100μl加至第2排进行2倍梯度稀释，如此稀释至第11排，从第11排吸取100μl弃去，第12排为阴性对照；

其中PK-15细胞的制备:

将生长致密的PK-15单层细胞用D-Hanks洗2次，加入浓度为0.25%的EDTA～胰酶消化细胞，消化完毕后，加入适量的培养基用吸管轻轻吹打，使细胞分散成单个细胞，取其中100μl，加900μl的D-Hanks液，混匀后滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法，于低倍镜下计数四角的4个大方格内的细胞，计数完毕后将细胞稀释到约1.0×10⁵个/ml，加入96孔板内，加细胞顺序从第12排阴性开始，从使每孔细胞数约为1.0×10⁴个，然后置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养，培养5天后备用；

其中间接免疫荧光法的检测:

1）细胞的固定，将培养5天的接种猪瘟兔化弱毒株的PK-15细胞板取出，将病毒液倒入废弃桶中，每孔加入200μl的PBST洗6次后，每孔加入100μl的4%福尔马林，固定10分钟；其中PBST是0.1mol/L的PBS中加入0.05%的吐温20配制所得；

2）一抗反应，固定完毕，每孔加入200μl的PBST洗6次，以1%PBA 1000倍稀释一抗，每孔加入50μl的一抗，置于室温反应1小时后,每孔再加入200μl的PBST洗6次；其中1%PBA，即PBS中加入1%BSA配制所得；

3）二抗反应，以1%PBA1000倍稀释FITC标记的兔抗猪的IgG二抗，每孔加入50μl的FITC标记的兔抗猪的IgG二抗，置于室温反应1小时，每孔加入200μl的PBST洗4次；

4）毒价的判定，将PBST倒干后，再加入50μlPBST，并于倒立于荧光显微镜下，判读猪瘟兔化弱毒株毒价，以Reed-Muench方式计算病毒毒价，以TCID₅₀/ml表示，测得兔体热反应和TCID₅₀之间的关系；

其中兔体热反应和TCID₅₀之间的关系的验证：

将未知兔体热反应和TCID₅₀的猪瘟兔化弱毒株首先进行TCID₅₀的测定，按照兔体热反应和TCID₅₀之间的关系将猪瘟兔化弱毒株稀释至1个兔体热反应，接种家兔，测定家兔的热反应。

2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：该方法避免了因家兔个体差异造成家兔定型热的假阴性和假阳性，确保所检测的猪瘟兔化弱毒株的兔体热反应的稳定性和可重复性。