[发明专利]形成用于电子显微镜的玻璃化样本

说明书

技术领域

本发明涉及形成玻璃化样本的图像的方法，该方法包括：

-提供包括样本材料的水溶液，

-在表面上喷射水溶液，

-通过冷却溶液来凝固溶液，

-形成带电粒子显微镜的样本室中的样本材料的图像。

背景技术

从H.D.White等人的“A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray”(J. Struct. Biol 144 (2003)，第246-252页，又称作White [-1-])已知这种方法。

在研究(成像、分析)透射电子显微镜(TEM)中的样本时，具有可选能量(例如在60 keV与300 keV之间)的高能电子束照射样本。样本应当充分薄，使得电子的较大部分通过样本以便成像/探测。成像例如可包括对荧光材料上的电子进行成像，或者对包括例如CCD或CMOS芯片的探测器上的电子进行成像。如本领域的技术人员已知，能够通过对样本扫描高能带电粒子(电子、离子、络离子)束并且观测响应碰撞带电粒子而从样本出现的辐射，来执行类似的成像或分析。这种研究随后在配备有扫描电子显微镜(SEM)镜筒和/或聚焦离子束(FIB)镜筒的设备的真空样本室中执行。

对于生物材料，需要研究例如电子显微镜的恶劣环境中、即真空中并且在高辐射级别下的组织。为此，样本材料常常冷却到低温温度。将生物材料冷却到低温温度涉及到不只是冷却材料，因为冷却通常通过形成冰针而引起对样本材料(细胞、细菌、病毒等)的损坏。如本领域的技术人员已知，样本材料应当嵌入作为非晶态冰的玻璃化冰中。通过以大约10⁵ K/s的速率将水溶液冷却到小于大约165 K的玻璃转变温度的温度来形成玻璃化冰。作为一个备选方案，在大约2100巴的压力下以“仅”大约600 K/s的冷却速率来执行玻璃化。当冷却速率较低时，更厚的玻璃化样本能够在这个所谓的高压冷冻(HPF)过程中形成。

例如通过在载体、例如TEM网片上涂敷水溶液的薄层，来形成玻璃化冰中的低温样本。多余的水随后通过吸出(blotting)去除，并且具有水溶液的其余载体随后投入诸如乙烷或液态氮之类的低温流体中。执行这种方法的设备的示例是以名称Vitrobot在市场销售的，并且由FEI 公司(Hillsboro，OR，USA)制造。

在White [-1-]所描述的方法中，当载体(仍然在室温下)正移动以便投入低温流体中的同时，在载体上喷射包括样本材料的水溶液：这样，过程能够被停止，因为它们在载体上喷射之后不久被冻结。

本发明意在提供形成低温样本的备选方法。

为此，按照本发明的方法的特征在于，喷射溶液的表面具有低温温度，因此，在微滴碰撞表面的时刻在该表面上形成玻璃化样本，并且当处于带电粒子显微镜的样本室中的同时微滴被喷射在低温表面上。

本发明基于如下认识：在低温表面上喷射小微滴时，微滴足够迅速冷却，以便凝固成非晶态冰，因而形成玻璃化样本。当原地(在带电粒子显微镜中)进行这个操作时，样本迅速地制备并且处于没有冰能够在这时低温的样本上生长的环境中。

要注意，估计对于直径大于10 μm的微滴，微滴的至少一部分的冷却过慢而无法形成玻璃化冰。优选地，因此，微粒的一部分应当具有小于10 μm、更优选地小于2 μm的直径。例如，微滴的准确最大尺寸取决于(例如)诸如甘油、乙二醇或者某些防冻蛋白质之类的低温防护剂的存在。在这种低温防护剂存在的情况下，直径可以更大。

要注意，在碰撞时，大概圆形微滴变形成具有更大面容比和较小‘厚度’的形状，因而增强冷却速率。

在按照本发明的方法的一个实施例中，在样本架上喷射水溶液，样本架通过与低温保持装置相接触来保持在低温温度。

样本架、例如TEM网片或SEM柱脚架优选地通过低温保持装置来保持，因此，样本架冷却到低温温度。这样，样本能够在样本架上制备，然后样本架能够从保持装置移开，以便交换用于形成另一个样本的另一个样本架。

样本架能够采用例如静电力来附连到保持装置。但是，也可使用其它附连方法，例如夹持。

在一个优选实施例中，样本架是装备成用于电子显微镜中的样本架。

在这个实施例中，样本架是用于SEM(常常称作柱脚架)或者TEM的所谓网片中的样本架。