[发明专利]一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法。 

背景技术

白介素(interleukin)，白细胞介素的简称，是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。两者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫调节功能。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。 

白介素－2即白细胞介素－2(interleukin-2，IL-2)，是白介素家族中的一员，又名T细胞生长因子，主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞产生，其具有广泛生物活性，可以作用于所有T细胞亚群。重组人白介素－2(rhIL-2)，通常由原核表达载体表达，与白介素IL-2相比，重组人白介素-2在N末端多一个甲硫氨酸Met，其具有人白介素-2的主要功能，可促进T淋巴细胞增殖，激活淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)，促进β－干扰素的产生，对免疫应答的产生和调节有重要作用，是目前调控免疫应答的重要因子，临床上已显示出具有较好的抗肿瘤活性。 

在用作外源蛋白质药物时，由于其具有不同于人白介素-2的结构，属于天然抗原，具有较强的免疫原性，反复注射会引发受试者的免疫反应，使得患者依从性较差。此外还会受到各种蛋白酶的攻击而容易失去生物活性，且生物半衰期短，无法充分发挥其生物活性，且为了维持其在体内有效的血药浓度，需要多次给药，导致患者依从性差，严重影响了其药理作用的发挥，限制了其临床应用。 

针对上述问题，研究人员采用了各种药物传递技术来提高其疗效，诸如采用不同的给药途径、不同的药物缓释控释技术、不同高分子材料的修饰等。而目前研究最为广泛和成熟的是聚乙二醇[Poly(ethylene glycol)，PEG]修饰技术。PEG具有良好的生物相容性，高度的亲水性，在水溶液中具有较大的水动力学体积，且无免疫原性。PEG修饰技术主要是通过PEG的端基活化后与蛋白药物或多肽上的残基基团进行反应形成PEG-蛋白偶联物。实验证明，PEG偶联的蛋白质药物或多肽可以延长蛋白质药物在体内的半衰期，降低其免疫原性和抗原性；另外还可以减弱蛋白酶的水解作用，增加蛋白分子的可溶性等。 

目前关于PEG修饰白介素-2的研究报道中，PEG的分子量大都采用5kDa~10kDa，所得到的偶联物是多修饰产物，均一性比较差，且活性损失较大，不易控制质量和放大生产。一般来说，分子量越小，在相同反应条件下的修饰率越高，对产物活性的影响也就越大。而采用分子量较大的PEG修饰时，由于会受到空间位阻作用，所得到的偶联产物将较为均一，且产物的活性损失也比较小。 

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，旨在解决PEG修饰重组人白介素2时出现的偶联产物均一性比较差，且活性损失较大的问题。 

本发明实施例是这样实现的，一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，包括以下步骤： 

用活化剂将单甲氧基聚乙二醇(mPEG)活化，得到单甲氧基聚乙二醇活化分子； 

将该单甲氧基聚乙二醇活化分子与重组人白介素2在pH为7.5~9.0的缓冲液中反应，然后加入甘氨酸溶液终止该反应，将反应产物分离纯化， 

其中该活化剂选自：琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺、对甲苯磺酸氯、N,N'- 羰基二咪唑、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、对硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亚胺酯。 

本发明实施例还提供一种由本发明的方法制备的聚乙二醇修饰的重组人白介素2。 

本发明的制备方法采用大分子量的mPEG来修饰重组白介素-2上的氨基残基，该方法步骤简单，易于操作，合成效率高，易于控制质量和放大生产。通过本发明的制备方法制得的聚乙二醇修饰的重组人白介素2能够保留较高的抗病毒活性，同时与未修饰的rhIL-2相比，其免疫原性较低，体内半衰期延长，血清清除率低，无需多次给药，而且本发明制备的mPEG-rhIL-2，其分子量均一性较好。 

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 

本发明实施例提供一种聚乙二醇修饰的重组人白介素2的制备方法，包括以下步骤： 

S01用活化剂将mPEG活化，得mPEG活化分子；