[发明专利]用于刺激树突状细胞成熟的组合物以及方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学、肿瘤免疫学和肿瘤免疫治疗领域，涉及人树突状细胞培养方法，尤其是涉及一种用于刺激树突状细胞成熟的组合物以及相关的和刺激树突状细胞成熟的的方法。 

背景技术

树突状细胞（DC）是免疫系统内最强大的抗原呈递细胞（APC）。通过抗原摄取、加工及呈递，DC细胞可有效诱导抗原特异性CD4及CD8 T细胞活化，从而激活获得性免疫反应。此外，DC细胞同样可激活NK细胞，增强其增殖能力及杀伤功能，从而增强先天免疫应激反应。因此，如何提高DC细胞的生物学活性，特别是充分发挥DC细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到医务工作人员的极大关注。在最近的一项III期临床试验中，接受DC疫苗治疗的肿瘤患者表现出肿瘤进展延缓、疾病稳定同时生存期延长，证实了DC疫苗在肿瘤免疫治疗中所发挥的作用。然而，尽管已经取得了一些好的结果，但现阶段的DC疫苗对于肿瘤患者的临床缓解率仍然很低。因此，有必要对现有DC细胞培养体系进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在临床治疗肿瘤中的作用。 

负载肿瘤相关抗原的成熟DC细胞（MDC）比未成熟的DC细胞（iDC）具有更强的刺激T淋巴细胞产生特异抗肿瘤免疫应答。许多微生物产物如脂多糖（LPS）、双链RNA（dsRNA）以及炎症细胞因子如TNF-α均可刺激DC细胞成熟。在抗肿瘤免疫反应中，Th1免疫反应被认为在抗肿瘤免疫中发挥重要作用；而Th2以及Treg反应则被认为起负面的作用。在这个过程中，DC细胞分泌的IL-12p70水平起了关键性的作用。高水平的IL-12被证实可有效极化Th1细胞的产生，从而辅助诱导抗原特异性的CD8+CTL细胞生成。此外，IL-12还可直接作用CD8+T细胞使其进行克隆增殖，扩大效应功能以及建立免疫记忆群。因此，能够分泌高水平的IL-12是DC细胞生物活性高的标志之一。然 而，尽管目前已经发现有很多制剂能够诱导DC细胞分泌IL-12，但其持续的过程很短暂，在撤去刺激物后，DC细胞分泌IL-12的能力很快在后续培养中消失。这种现象被称之为“DC细胞衰竭”。而在无血清培养体系中，“DC细胞衰竭”现象尤为突出。“DC细胞衰竭”现象可能也部分解释了现阶段DC疫苗在临床肿瘤治疗中表现出来的缓解率较低的重要原因之一。如最近的一项III期临床试验，采用了所谓“金标准”的成熟剂组合，其中包含了IL-1、IL-6、TNF-α以及PEG2，制备成熟的DC细胞疫苗。但在针对晚期的黑色素瘤患者治疗中，并未使疗效显著提高。研究者认为一个可能的原因是使用了PGE2，虽然能够提高DC细胞CCR7的表达水平并增强其向二级淋巴结迁移的能力，但是却会显著抑制IL-12的生成，造成严重的“DC细胞衰竭”现象。因此，有必要寻求更为优化的DC细胞培养方法，使DC细胞能够稳定分泌IL-12，从而在体内诱导更有效的抗肿瘤免疫反应。 

长期以来，如何在树突状细胞培养过程中提高树突状细胞（DC）的生物学活性，有效刺激T淋巴细胞增生，诱导产生更强的抗肿瘤的特异性免疫应答一直是困扰人们的一大难题。由于这一技术的难于解决，使得树突状细胞在临床肿瘤治疗中受到极大的限制，临床治疗肿瘤患者的缓解率很低。如何在树突状细胞培养过程提高其生物学活性，使其能有效刺激的T淋巴细胞能大量扩增，并诱导产生更强的抗肿瘤的免疫应答是目前研究的热点。到目前为止，大量研究表明：树突状细胞疫苗在临床肿瘤治疗中对肿瘤患者的缓解率低的最主要原因是培养的树突状细胞的生物学活性难于持续维持，造成严重的所谓“DC细胞衰竭”，从而难于诱导机体产生强大的抗肿瘤免疫反应。 

临床级药物OK-432在过去的研究中已被证实是DC细胞一种有效的成熟剂，可增强DC细胞表面标记物的表达以及炎症细胞因子的分泌，进而有效诱导抗肿瘤免疫反应。然而，这种方法仅仅是发现在OK-432刺激物存在的情况下，DC细胞能够分泌高水平的IL-12；在撤去OK-432刺激物后，DC细胞分泌IL-12的能力明显降低，特别是在无血清培养体系中，这种现象表现的更为突出。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于刺激树突状细胞成熟的组合物，采用该组合物刺激树突状细胞（DC）所制备的成熟DC细胞具有持续分泌IL-12的能力，能持续保持树突状细胞的生物学活性，进而能更有效地诱导Th1的抗肿瘤免疫及抗肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。 

本发明所述的用于刺激树突状细胞成熟的组合物，包括OK-432与IFN-γ，在每毫升树突状细胞培养液中，OK-432的用量是5-10μg/ml，IFN-γ的用量是500-1000U/ml。