[发明专利]一种定向诱导间充质干细胞分化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定向诱导间充质干细胞分化的方法。 

背景技术

在体内或体外特定的诱导条件下，间充质干细胞（MSCs）不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等中胚层间质组织细胞,还可跨越胚层界限,分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞等。所以近年来MSCs成为基础医学和临床医学组织器官损伤修复以及再生领域研究的热点。而实现MSCs向表皮细胞的分化是利用其构建组织工程皮肤的关键步骤之一。 

MSCs分化的程序是可能存在于其生存的微环境中的指导信号，通过相应的信号转导通路，启动并强化关键基因表达，实现细胞分化。其实质就是MSCs的基因在时空上特异性表达，合成相应的蛋白质，从而细胞在生化、结构和功能方面发生改变，细胞表型随之差异表现。 

指导转录因子及启动基因表达的信号可能存在于MSCs生存的微环境中，研究表明，微环境中的各种因子表现类型、浓度和应用次序则是影响MSCs分化的重要因素。细胞局部的微环境包括细胞周围多种细胞因子、激素、基质细胞、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等，细胞因子的作用尤为重要，不同的细胞因子作用下MSCs可分化为不同的细胞类型。除了可溶性细胞信号分子外，直接的细胞-细胞相互作用对于干细胞的分化也是必要的。Rangappa等利用接触培养和条件培养两种方法培养人骨髓间充质干细胞和心肌细胞后，发现混合培养组用CMFDA标记的骨髓间充质干细胞表达肌球蛋白重链、β-actin和cTnT，而条件培养组只有β-actin表达。体内外实验均显示，MSCs与其他细胞（蒲肯野细胞、心肌细胞和肝细胞等）共培养时有自发的细胞融合，且MSCs在没有诱导剂的情况下分化成其他细胞，提示细胞融合可能是促使MSCs分化的原因之一。 

MSCs的分化与其生长的微环境有密切关系，因此，体外诱导MSCs分化是通过采取不同的方法模拟体内相应组织细胞生长的真实环境和必要条件。 

利用目标细胞参与进行共培养诱导的方法往往比较简便易行。直接接触式共培养利用MSCs与其他细胞共培养时有自发的细胞融合，或细胞的自分泌与旁分泌必要的细胞因子，MSCs在没有诱导剂的情况下分化成其他细胞。但这种诱导方法存在两种细胞的分离比较困难的最大缺点，为后续的鉴定或应用带来障碍。 

发明内容

本发明的目的是提供一种定向诱导间充质干细胞分化的方法。 

本发明提供了一种定向诱导间充质干细胞分化的方法，包括如下步骤：将离体的诱导细胞接种并吸附于聚碳酸酯膜的下表面，将离体的间充质干细胞接种至所述聚碳酸酯膜的上表面，然后将所述诱导细胞和所述间充质干细胞共培养，促使所述间充质干细胞分化为目标细胞；所述间充质干细胞和所述诱导细胞均不能通过所述聚碳酸酯膜的孔径。所述目标细胞为非胚胎干细胞。 

所述诱导细胞可为表皮干细胞，具体可为人表皮干细胞。所述目标细胞可为表皮干细胞，具体可为人表皮干细胞。所述间充质干细胞可为脐带间充质干细胞，具体可为人脐带间充质干细胞。 

所述聚碳酸酯膜的孔径可为0.2μm-2.0μm，优选为0.4-1.0μm，更加优选为0.4μm或1.0μm。 

所述共培养具体可在细胞培养板的培养孔和放置于所述培养孔上的Transwell小室中进行。所述共培养时，所述诱导细胞的培养在细胞培养板的培养孔进行。所述间充质干细胞的培养在Transwell小室中进行。所述聚碳酸酯膜可以阻断细胞通过，所述诱导细胞分泌的诱导因子通过所述聚碳酸酯膜后诱导间充质干细胞定向分化为具有所述诱导细胞属性的目标细胞。 

所述表皮干细胞表现为表达P63、CK19和β1-integrin的细胞。P63、CK19和β1-integrin是三种早期表皮细胞的标志物，P63经常用来鉴定表皮干细胞，而CK19和β1-integrin是表皮干细胞相对特异的标志物。缺乏β1-integrin会显著影响体外角质细胞的分化，而持续表达的β1-integrin对于维持表皮干细胞的特性是重要的。