[发明专利]胰岛素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及将胰岛素前体转化为长效活性胰岛素化合物的改进的方法。

背景技术

胰岛素是参与血糖浓度调节的一种胰腺激素。例如，将人、猪和牛的胰岛素、胰岛素类似物和混合胰岛素给予胰岛素依赖型糖尿病患者，以调节他们的血糖浓度。

成熟胰岛素是一种两条链的肽激素，含有51个氨基酸。其A-链由21个氨基酸组成，B-链由30个氨基酸组成。该分子在A-链内含有2个链间二硫键和1个链内二硫键。在体内，该激素首先被合成为一条长的前体分子，即前胰岛素原(preproinsulin)，随后被加工为胰岛素原(proinsulin)和胰岛素。最初的加工步骤是在初生链穿过内质网膜转移期间经蛋白水解而除去前肽。然后，胰岛素原折叠并伴随二硫键氧化并转运至高尔基体，在此包装成为分泌液泡。在此经特异性蛋白酶进一步加工形成成熟胰岛素。通过这样的蛋白水解切割，将胰岛素原中与B链和A链连接的C-链(C肽)切去。C肽长度为35个氨基酸并在其氨基端和羧基端分别包含2对碱性氨基酸，即ArgArg和LysArg(Steiner，1984)。假定将两条胰岛素链连接在一起的C肽有助于合适的折叠和二硫键的形成。事实上，其缺失或被仅有数个氨基酸长的较短的合成肽桥取代，仍然允许自胰岛素-样前体产生合适的胰岛素。

直到20世纪80年代，才从牛和猪的胰腺制品中分离出胰岛素。早期研究已经证明，可通过将呈S-磺酸形式的A链和B链结合或通过还原型胰岛素原的自发再氧化而在体外产生胰岛素。然后再经胰蛋白酶和羧肽酶B处理而回收胰岛素。然而，这些方法对于大规模生产来说并不实用。以后，通过转肽作用(例如美国专利号4,343,898)，使用胰蛋白酶和苏氨酸，替代猪胰岛素中的B30丙氨酸(猪胰岛素和人胰岛素之间的唯一差异)，可自猪胰岛素产生半合成人胰岛素。

例如EP87,238提供了在溶剂系统中进行的转肽反应，所述溶剂系统包含介于大约75%至97%(v/v)之间的至少一种非水反应易混溶剂，其包含至少大约50%(vol/vol)丁-1,4-二醇。通过使用L-丝氨酸特异性羧肽酶而进行的转肽方法公开于美国专利号4,579,820。

发明内容

在一个实施方案中，本发明提供一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：(a)可逆地封闭Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH6-11的溶液；和(b)切割所述Arg-Arg前体胰岛素，包括使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应，从而制备胰岛素。

在一个实施方案中，本发明还提供一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：将Arg-Arg前体胰岛素暴露在11.0-11.5的pH值下；(b)可逆地封闭所述Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH6-11的溶液；和(c)切割所述Arg-Arg前体胰岛素，包括使步骤(b)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应，从而制备胰岛素。

在一个实施方案中，本发明还提供一种制备胰岛素的方法，所述方法包括以下步骤：(a)可逆地封闭Arg-Arg前体胰岛素中的赖氨酸残基，包括使所述Arg-Arg前体胰岛素接触包含缓冲液和柠康酸酐的pH9的溶液；(b)切割所述Arg-Arg前体胰岛素，包括使步骤(a)的所述Arg-Arg前体胰岛素与胰蛋白酶反应；和(c)将步骤(b)的所述胰岛素的pH调节至pH6-10(步骤(c))，从而制备胰岛素。

在一个实施方案中，本发明的方法还包括胰岛素纯化操作，例如：微滤、离子交换色谱法、反相高压液相色谱法(RP-HPLC)或其任意组合。

在一个实施方案中，本发明的方法还包括胰岛素结晶，包括在柠檬酸-乙醇(pH6.4)中使所述胰岛素接触Zn++。

附图说明

图1是描述自Arg-Arg胰岛素前体制备本发明胰岛素的方法流程。

图2是胰岛素-ArgArg生产流程。

图3是纯化胰岛素-ArgArg与市售来得时比较的RP-HPLC分析图。胰岛素-ArgArg之前的峰是防腐剂间甲酚。

图4是本发明的重组人胰岛素-类似物前体表达盒的核苷酸序列和相应氨基酸序列。B链氨基酸在方框内。A链氨基酸在方框内。在胰岛素-类似物序列和Arg Arg桥之前的最初64个氨基酸(编码Cu/Zn-超氧化物歧化酶的部分序列)用粗体表示。RBS-核糖体结合位点。