[发明专利]一种新的制备肝实质细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种新的制备肝实质细胞的方法。

背景技术

肝脏是人体最重要的器官之一，调控着多种生理功能。肝脏本身具有很强的再生能力，但是在罹患各种肝脏疾病，包括肝炎，肝纤维化，肝癌，肝脏代谢疾病和肝功能衰竭时，肝脏逐渐失去再生能力，从而导致其生理功能的下降，最终危害着人们健康和生命。由于饮食、环境和遗传等因素的影响，中国是世界上终末期肝病和急性肝衰竭发病人数最多的国家。

对于终末期肝病以及急性肝衰竭的治疗，目前唯一有效手段是进行肝脏移植。但是由于肝脏供体紧缺以及术后免疫系统对异体器官的排斥，移植手术的发展受到了严重的制约。最近基于肝细胞移植的技术受到广泛的关注。其中一个在临床上已经使用的方法是将供体肝脏消化后得到的肝细胞移植入病人，从而使得一个供体器官可以治疗若干个病人。然而该方法仍旧依赖于捐献的供体器官，并且不能改变移植后的免疫排斥。此外，体外培养的肝细胞还是一个非常好的药物肝脏代谢模型，被制药公司大量使用在药物开发早期检测代谢毒性实验中。因此如何获得稳定而大量的肝细胞来源，成为目前最迫切的需要。随着对干细胞研究的深入和新技术的突破，利用干细胞或其他细胞来分化获得肝细胞被普遍认为是未来的发展方向。从干细胞获得肝脏细胞主要有以下的一些方法：

方法一、从人胚胎干细胞(hES细胞)定向分化成肝细胞。最近的研究包括中国科学家在内的工作已经表明，在使用特定的培养基和细胞因子的条件下，hES细胞可以被定向的分化成具有肝细胞功能的细胞。并且利用这些分化的肝细胞，在动物实验也已经验证这些细胞在体内可以表现出功能。

方法二、利用来源于脐带中分离的间充质干细胞来获得肝细胞。现有的证据表明分离纯化的脐带间充质干细胞可以在体外分化成非常接近肝细胞的细胞，并且脐带间充质干细胞到注射肝脏内后可以分化表达许多肝细胞特异的功能蛋白。中国的科学家也发现用脐带间充质干细胞可以改善晚期肝硬化病人的肝功能。这些研究工作都指出脐带间充质干细胞极有可能是在体外大量获得肝细胞的另一个来源。

方法三、上述的方法都受到了取材的限制，特别是ES细胞的获得存在很大的伦理道德问题。此外这些干细胞并非来自病人自身，因而由其分化而来的肝细胞还是不能避免移植后免疫排斥的问题。因此有人提出用人类iPS全能干细胞定向分化成为肝细胞。将病人自身终末分化细胞诱导为iPS全能干细胞，再定向分化iPS全能干细胞为有肝细胞功能的细胞。目前中国和美国的科学家已经报道成功的把人类iPS细胞定向分化成了具有肝脏功能的细胞。

但是无论由ES干细胞，iPS干细胞还是脐带干细胞定向分化获得细胞，都不可能达到完全分化的效率，所以总有少量的干细胞存在于分化的细胞中。这些残存的干细胞注射入动物体内后可以形成畸胎瘤和腺瘤，因此严重影响了这些细胞的应用。最近的研究表明，B淋巴细胞可以在体外直接转变为巨噬细胞，另外成纤维细胞可以在体外直接重编程为神经细胞。这些实验证据提出了这样一种可能性，即各种不同类型的终末分化的动物细胞之间是可以直接转化的。

在正常生理条件下，人们一般认为动物干细胞向终末分化细胞的分化过程是单向且不可逆的。但人们也发现在自然界存在少量已分化细胞转变为另一类型细胞的例子。最典型的例子包括蝾螈的断肢再生和果蝇成虫足原基转决定为翅膀。这说明已分化细胞依然能被重编程，具有可塑性。人工诱导细胞重编程最早成功于上世纪的五十年代。John Gurdon用细胞核移植的方法诱导爪蟾成体细胞重编程并获得成功，从而证明脊椎动物终末分化细胞的细胞核也能被重编程到全能状态。2006年Shinya Yamanaga等发现的iPS技术，成功实现了成体细胞退分化为多能干细胞，从而开创了细胞重编程的新领域。

随着细胞核移植技术和iPS技术的发展，人们又开始关注不经历多能干细胞阶段的成体细胞之间的相互转化。早在上世纪八十年代，人们就发现小鼠的纤维细胞在用小分子化合物处理或表达某些外源基因时可转分化为成肌细胞和脂肪细胞。而近年来，通过过表达特定的基因，人们在体内和体外实现了亲缘关系较近的细胞之间的转化，如：通过在B细胞中过表达C/EBPalpha和C/EBPbeta转录因子将B细胞重编程为巨噬细胞。最近通过在小鼠胚胎纤维细胞中过表达Ascl1、Brn2和Myt1转录因子将其在体外重编程为神经细胞。这些研究说明成体细胞进行跨胚层的转化，即亲缘关系较远的细胞之间的转化是可以实现的。