[发明专利]zfx基因的RNA干扰片段及其控制小鼠性别的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及能够沉默zfx基因的RNA干扰片段及其应用。 

背景技术

在自然条件下，几乎所有哺乳动物的性别比例都接近1:1，从而实现了无间断地进行稳定地繁衍后代，在自然的条件下达到生态平衡。对于畜牧生产实际而言，理想的性别比例具有十分重要的意义。利用泌乳、产蛋性状进行生产的生产企业希望得到更多的雌性个体，而产肉、产毛性状的在雄性个体上表现得优势性更加明显。一直以来，人类对控制动物后代的性别就有着极大的兴趣。目前性别控制主要从受精前和受精后两个方面进行，前者应用精子分离后再进行受精，使得在受精时就决定了后代的性别；后者采用早期胚胎性别鉴定，进行胚胎的性别筛选的方法来控制后代的性别。 

哺乳动物性别决定理论认为，性染色体为“XX”的受精卵就能够发育成雌性个体，而性染色体为“XY”的就会发育成雄性。那么从根本上讲，控制家畜性别最理想的方法是先分离X、Y精子，然后再进行受精，就能人为地控制后代的性别，理论上这是在性别控制中最简单、最经济的途径。自20世纪50年代后，关于精子分离的研究报告很多，这些研究都试图利用X精子和Y精子不同的物理特性(体积、密度、电荷、运动性))，采用离心法、电泳法、离子交换法、细胞表面抗原法等不同的方法来实现精子的分离，但是都有一个共同的问题——可重复性差。而而且这些差异随着环境条件的不同而发生变化，因此，许多研究结果常常不一致，甚至出现相反的结论，致使两类精子某些差异性研究存在争议。到目前为止，除了X、Y精子DNA含量具有差异可以肯定之外，其他方面的差异表现很小，甚至难以确定。但是随着分子生物学技术的不断发展，以及研究工作的继续深入，新的研究成果将会不断涌现。 

目前根据哺乳动物X、Y精子DNA含量存在差异的原理，利用流动细胞检索仪进行分离X、Y精子，分离效果最好，纯度可达 90%以上，但是由于设备昂贵，分离速度慢，用于受精的精子数量少、活力差等原因，远远不能满足生产上对性控精液的大量需求。相比之下，如果能够找到两种精子发育或受精过程中，甚至胚胎发育时关键性的X、Y染色体特异mRNA，结合当代新兴的分子生物学技术利用RNA干扰(RNA Interference，RNAi)的方法则有望以较低的成本，简便、快速地实现对动物的性别控制。 

RNAi是一种转录后的基因沉默 (Post-transcriptional Gene Silencing， PTGS)现象，通过体外人工合成或体内产生的双链RNA(Dubble-stranded RNA.dsRNA)在细胞内特异性地降解其同源的mRNA，使得相应的基因干扰，实现阻止目标基因的表达。RNAi方法能够快速、简便、有效、特异地下调细胞中的基因表达，它不但是研究基因功能的一种有力工具，而且也为特异性基因治疗提供了新的技术手段，其应用前景十分广阔。 

在基因组、mRNA和蛋白水平的研究都证明，X、Y精子基因表达的确存在差异。基因表达检测研究表明，在精子形成的减数分裂粗线期，为防止一些酶类与性染色体发生作用，两条性染色体高度浓缩形成性体体。性体的形成保护了性染色体，性染色体上特殊基因的表达被关闭。因此，哺乳动物成熟精子中没有mRNA的转录，然而哺乳动物成熟精子中却含有mRNA，这种差异来自精子发生过程中的转录，其翻译远落后于转录。这些mRNA是精子成熟后指导合成一些必须的蛋白，或者是受精后对卵母细胞mRNA库的补充，或作为RNAi对生育和胎儿生长发育起着关键的作用。 

Hendriksen等对小鼠的研究发现，减数分裂过程中，除Xist基因表达外，几乎所有的性染色体基因都没有表达，然而减数分裂后期，一些性染色体特异基因开始表达。减数分裂后，检测到Y染色体上Ubely和Sry基因具有较高的mRNA水平；在X精子中也检测到Ubelx基因mRNA高水平表达，同时发现X染色体特异基因Mhr6A的表达产物。另外还有人发现X、Y染色体其他特异基因的表达，如X染色体特异基因Akap82(精子尾部的骨架蛋白 )及Nap-X(编码一种核相关蛋白 )，Y染色体特异基因Zfy-1、Zfy-2及Y353/B。