[发明专利]修饰的小干扰核酸及其制备方法

说明书

本申请是申请日为2009年4月3日、申请号为200910081145.8、发明名称为“一种修饰的小干扰核酸及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及一种修饰的小干扰核酸及其制备方法。 

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭同源基因的表达或使该基因表达沉默的现象。RNA干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有关RNA干扰的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象，以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了RNA干扰现象。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，被称为小干扰核酸(siRNA)。双链siRNA与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。在RNA干扰过程中，双链siRNA中的正义链被排除出复合体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，从而关闭靶基因的表达。 

但是，由于小干扰核酸(siRNA)的稳定性较差，在体内容易被核酸酶降解，因此人们对合成的siRNA进行化学修饰，以增加siRNA的血清稳定性，从而有效地抑制目的基因的表达。 

目前，由于人们对siRNA在血清中的降解过程和机制缺乏足够的了解，只能依靠各自的经验随机地选择siRNA分子中的多个核苷酸进行化学修饰。这种修饰策略虽然能很好地提高siRNA分子的血清稳定性，但由于缺乏理论的指导，通常在siRNA分子中引入了过量的修饰，增加了修饰后的siRNA的潜在细胞毒性，并在很多情况下降低了siRNA的生物学活性，因而制约了修饰后的siRNA在体内的应用。 

另外，在siRNA中盲目地在核苷酸中引入大量修饰的做法，也限制了一些具有较好稳定效果，但细胞毒性相对较大的修饰方法在体内研究中的应用。 

因此，设计具有针对性的修饰方案，通过最少的修饰来实现最优的稳定性目的是目前迫切需要解决的问题。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有的siRNA的修饰方案中存在盲目地引入大量的修饰从而导致得到的修饰的小干扰核酸细胞毒性大问题，提供一种血清稳定的、具有良好生物活性的且细胞毒性较低的修饰的小干扰核酸。 

本发明提供了一种修饰的小干扰核酸，其包括第一片段和第二片段，并且所述第一片段和第二片段能够形成双链区域，所述第一片段包括至少一个连续的CA序列或UG序列，所述第二片段包括至少一个与所述第一片段的CA序列或UG序列互补的连续的UG序列或CA序列，所述第一片段的CA序列或UG序列与所述第二片段的UG序列或CA序列形成CA/UG位点，其中，所述CA/UG位点中的至少一个核苷酸是经过修饰的，该修饰使修饰的小干扰核酸的稳定性高于未修饰的小干扰核酸，所述第一片段为5’-UGAACGUCACCGAGGAGAATT-3，第二片段为3’-TTACUUGCAGUGGCUCCUCUU-5’。 

优选地，所述CA/UG位点中，只有胞嘧啶核苷酸是经过修饰的。 

优选地，除了所述CA/UG位点中的核苷酸以外，其它核苷酸是未经过修饰的。 

本发明提供的修饰的小干扰核酸，其中，所述修饰为如下的修饰中的至少一种： 

(1)对所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰； 

(2)对所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的修饰； 

(3)对所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。 

优选地，所述修饰为对所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH的修饰。 

进一步优选地，所述修饰为所述修饰的小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’-OH被甲氧基或氟取代。