[发明专利]一种提取哺乳动物和鸟类粪便DNA的方法

权利要求书

1.一种从动物粪便中提取并纯化总DNA的方法，包括如下步骤：

（1）样品前处理：为如下A）或B）：

A）若待测粪便成形，则进行如下A1）或A2）：

A1）若所述粪便体积大于等于1×1×1cm³，且所述粪便表面有粘液层，则取所述粘液层作为待测样品；

A2）若所述粪便体积小于1×1×1cm³，或所述粪便表面没有粘液层，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；

B）若待测粪便不成形，则将所述粪便用液氮研磨，将研磨后样品作为待测样品；

（2）从步骤（1）所得待测样品中提取待纯化总DNA：为如下（a）-（d）：

（a）将所述待测样品置于pH8.0的缓冲液中，混匀后于56-60℃保温8-12min，得到样品混合液；

所述待测样品与所述pH8.0的缓冲液的配比为0.3g：1mL；

（b）将步骤（a）得到的样品混合液以500g离心5-10min，取上清液；

（c）除去步骤（b）得到的上清液中的蛋白，得到样品裂解液；

（d）对步骤（c）得到的样品裂解液进行DNA抽提和DNA沉淀，得到待纯化总DNA；

（3）对步骤（2）得到的待纯化总DNA进行纯化：为如下（I）-（II）：

（I）将步骤（2）得到的待纯化总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有所述待纯化总DNA的胶块，向所述胶块中加入溶胶液，于65-75℃溶胶，得到待过柱样品液；所述胶块与溶胶液的配比为1mg：3μl；

（II）将步骤（I）得到的待过柱样品液加入到硅胶膜DNA吸附柱内，进行DNA纯化，得到纯化后的总DNA样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤（2）（c）中，所述除去步骤（b）得到的上清液中的蛋白，包括如下步骤：向步骤（2）（b）得到的上清液中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸钠，于54-58℃裂解1-1.5h；

所述上清液、所述蛋白酶K和所述十二烷基磺酸钠的配比为0.6mL：150μg：15mg。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在步骤（2）（d）中，所述DNA抽提采用的抽提液为苯酚-氯仿-异戊醇和/或氯仿-异戊醇；所述苯酚-氯仿-异戊醇是由苯酚、氯仿和异戊醇按照体积比25：24：1的比例混合而成的混合液；所述氯仿-异戊醇是由氯仿和异戊醇按照体积比24：1的比例混合而成的混合液；所述DNA沉淀采用的沉淀液为无水乙醇和/或乙酸钠水溶液。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在步骤（2）（d）中，所述DNA抽提和DNA沉淀，包括如下步骤：

a1）向步骤（2）（c）得到的样品裂解液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，混匀，以10000g离心5min，回收上清液；

a2）向步骤a1）的上清液中加入等体积的所述苯酚-氯仿-异戊醇，混匀，以10000g离心5min，回收上清液；

a3）向步骤a2）的上清液中加入等体积的所述氯仿-异戊醇，混匀，以10000g离心5min，回收上清液；

a4）向步骤a3）的上清液中加入2.5倍体积的无水乙醇，以及1/10体积的乙酸钠水溶液，于-20℃放置20min，12000g离心10min，得到总DNA沉淀；

所述乙酸钠水溶液的pH为5.2，乙酸钠的浓度为3M；

a5）将步骤a4）得到的总DNA沉淀用70%乙醇洗涤一遍，干燥后得到所述待纯化总DNA。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：在步骤（3）（I）中，所述溶胶液是浓度为5M的碘化钠水溶液。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：在步骤（3）（II）中，所述DNA纯化，包括如下步骤：

b1）将步骤（I）得到的待过柱样品液加到所述硅胶膜DNA吸附柱中，12000g离心1min，向柱内加入500μl的70%乙醇，以12000g离心1min，重复加入500μl的70%乙醇，再以12000g离心1min；

b2）将柱子转移至1.5mL离心管中，开盖放置2min，向柱子膜中央部位加入100μl60℃预热的TE缓冲液，静置5min后，以12000g离心1min，得到所述纯化后的总DNA样品。