[发明专利]一种检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物及可视化试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及猪感染乙型脑炎病毒的快速检测试剂盒及引物。

背景技术

流行性乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），简称乙脑病毒，所引起的疾病简称乙脑，乙脑是一种人畜共患的病毒性传染病，可以感染人类和多种动物，可以导致人的中枢神经系统疾病和猪的繁殖障碍，严重危害着人类的健康和畜牧业的发展。

乙脑病原学实验室诊断方法可以检测病例的脑组织、胎儿、胎盘以及体液等中的病毒抗原。目前的诊断方法有：免疫细胞化学法、反向被动血凝试验、荧光抗体染色法和RT-PCR技术。日本长崎大学运用基因扩增的传统方法，发展了实时环介导逆转录等温扩增技术(reverse transcription loop-mediatedisothemal amplification，RT-LAMP)，检测JEV的敏感性可以达到1PFU。

然而，上述现有技术仍存在着缺点和不足：①实验结果的判断不够迅速直观；②需要贵重仪器设备，不利于推广；③检出效率还不够高。

发明内容

本发明的主要目的是，针对上述现有技术存在的缺陷提供一种可以用肉眼迅速判定实验结果，并利用环引物加强反应的检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一对检测猪流行性乙型脑炎病毒的环引物，其应用于环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）中，其特征在于，该对环引物包括：

上游环引物（FL），其序列如序列表SEQ ID No.5所示：5’-CAGAATTTTCCTGGTTTTCC CTGA-3’；

下游环引物（BL），其序列如序列表SEQ ID No.6所示：5’-GGTGGTAGCAGCAGAAATGG CA-3’。

一组检测猪流行性乙型脑炎病毒的引物，其应用于环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）中，其特征在于，该组引物包括：

上游内部引物（FIP），其序列如序列表SEQ ID No.1所示：5’-CGCTGCTGGATAGCGTCCTT GAATTCGTGC TAGATTTGCA CCCTGG-3’；

下游内部引物（BIP），其序列如序列表SEQ ID No.2所示：5’-AAGAACAGCT GTGTTGGCAC CGGATATCGT ACTGGGAGCC CT-3’；

上游外部引物（F3），其序列如序列表SEQ ID No.3所示：5’-ACACCCCAAACATGTTGAGA-3’；

下游外部引物（B3），其序列如序列表SEQ ID No.4所示：5’-CTCTCTGCACTGCTGAAGTT-3’；

上游环引物（FL），其序列如序列表SEQ ID No.5所示：5’-CAGAATTTTCCTGGTTTTCC CTGA-3’；

下游环引物（BL），其序列如序列表SEQ ID No.6所示：5’-GGTGGTAGCAGCAGAAATGG CA-3’。

检测猪流行性乙型脑炎病毒的可视化试剂盒，其特征在于，其组成为：

10×Thermopol反应缓冲液；

10mmol/L dNTPs；

乙脑病毒总RNA；

上游内部引物FIP，其序列如序列表SEQ ID No.1所示；

下游内部引物BIP，其序列如序列表SEQ ID No.2所示；

上游外部引物F3，其序列如序列表SEQ ID No.3所示；

下游外部引物B3，其序列如序列表SEQ ID No.4所示；

上游环引物FL，其序列如序列表SEQ ID No.5所示；

下游环引物BL，其序列如序列表SEQ ID No.6所示；

Bst DNA聚合酶大片段；

AMV反转录酶；

20×SYBR Green I；

DEPC ddH₂O。

如上所述的可视化试剂盒在非活体样品的猪流行性乙型脑炎病毒检测中的应用，其特征在于，其步骤为：

（1）在反应管中加入以下组分并混匀：

10×Thermopol反应缓冲液，2.5μL；

待测样品总RNA5.25μL，阳性对照反应管中则加入阳性样品总RNA5.25μL；

8U/管Bst DNA聚合酶大片段，1μL；

AMV反转录酶0.25μL；